Carcinoma de pulmón no celula pequeña, con mutación de KRas: diferenciación y caracterización de subtipos, así como de los diferentes mecanismos de resistencia, para la elaboración de tratamientos dirigidos

Abstract

Introducción: El cáncer de pulmón es el tercer tumor más frecuente y produce más de 20.000 muertes al año en España. Pese a los avances en oncología, la quimioterapia e inmunoterapia son los únicos tratamientos para pacientes con mutación de KRAS, con resultados subóptimos. Objectivos: Evaluar las diferencias pronósticas entre los subgrupos de pacientes con mutación de KRAS en función de la expresión génica. Encontrar relación entre la expresión de los siguientes genes (HES1, CDCP1, AXL, YAP1, CREB, LKB1, Src y STAT3). Evaluar el efecto de TPX0005 (inhibidor de Src/Fak) y trametinib (inhibidor de MEK), en monoterapia y en combinación en 4 líneas celulares de cáncer de pulmón con mutación de KRAS (H23, A549, H460 y Calu-6) y estudiar sus mecanismos de acción en dichas líneas celulares. Resultados: se incluyeron 32 pacientes con mutación de KRAS. El 71.88% eran hombres con una edad media de 59 años, 97% fumadores o ex fumadores. G12C y G12V (28.13% cada uno) fueron las mutaciones de KRAS más frecuentes seguidos por G12D (12.5%). El tratamiento de primera línea más frecuente fue la combinación con platino (65,66%). 34,38% de los pacientes tuvieron respuesta parcial, 9,38% enfermedad estable y 25% progresión de la enfermedad. La mediana de supervivencia libre de progresión (SLP) fue de 3,4 meses y la supervivencia global (SG) 13,4 meses. Encontramos una correlación significativa mediante el test de Spearman entre HES1 y STAT3, CREB1 y LKB1, CREB1 y Src, CREB1 y STAT3, Src y STAT3, Src y YAP1, STAT3 y YAP1. Los pacientes con alta expresión de Src tuvieron SLP de 1,6 meses frente a 4,1 meses para aquellos con baja expresión (HR = 2,469 IC 95% (1,110-5,495) p=0,0215). Los pacientes con alta expresión de LKB1 tuvieron una SLP de 4,2 meses frente a 0,7 meses (HR = 0,344 IC 95% (0,128-0,924) p=0,0259) para aquellos con baja expresión. Finalmente, los pacientes con baja expresión de CDCP1 tuvieron una SLP de 4 meses frente a 0.7 meses para aquellos con alta expresión (HR=5,495; IC 95% (1,574-19,231) p=0,0025). Los pacientes con alta expresión de CDCP1 presentaron una SG de 3,2 meses frente a 16,3 meses para aquellos con baja expresión (HR=0,97(0,020-0,460) p=0,0005. Aquellos pacientes con alta expresión de LKB1 tuvieron una SG de 19.4 meses en comparación a 1.1 meses para aquellos con niveles bajos (HR= 0,097 (0,020-0,460) p= 0,0005). Los estudios de viabilidad realizados en las líneas celulares mostraron que la combinación fue aditiva en la línea celular A549 y sinérgica en las otras tres líneas celulares (H23, Calu6 y H460). El análisis Western blot demostró la inhibición de la fosforilación de histona 3 por TPX0005 en monoterapia y con la combinación en Calu 6, H23 y H460. TPX0005 bloquea la fosforilación de histona 3 tras 2 horas de la administración del fármaco. El efecto del tratamiento sobre la morfología celular mostró que TPX0005 causa la formación de células binucleadas y aberrantes. Por inmunofluorescencia se encontró que TPX0005 bloqueaba la mitosis entre la profase y la metafase, mientras que el trametinib detenía las células en la fase G1. Conclusiones: el cáncer de pulmón no microcítico con mutación KRAS es una enfermedad heterogénea con un comportamiento agresivo y un mal pronóstico para los pacientes. Las relaciones encontradas entre la expresión de los diferentes genes estudiados confirman el racional biológico planteado en nuestro estudio. Encontramos un grupo de pacientes con KRAS con mejor pronóstico basado en los niveles de expresión de Src, CDCP1 y LKB1. La combinación de trametinib con el inhibidor de Src/FAK fue sinérgica en la mayoría de las líneas celulares con mutación de KRAS examinadas.

Introduction: Lung cancer is the 3rd most frequent tumor and produces more than 20,000 deaths per year in Spain. Despite recent advances in oncology chemotherapy, and inmunotherapy remains the only remedy for patients whose tumor is driven by RAS mutations, with suboptimal results. Objectives: To evaluate the differences between subgroups of KRAS mutant patients depending on expression as well as the effect of gene expression on treatment outcome and prognosis. Find relation between transcripts (specifically, HES1, CDCP1, AXL, YAP1, CREB, LKB1, Src and STAT3). To evaluate the effect of the Src/Fak inhibitor, TPX0005, and the MEKinhibitor trametinib, alone and in combination in 4 KRAS mutant lung cancer cell lines (H23, A549, H460 and Calu-6). To study the mechanisms of action of Trametinib, TPX0005 and the combination in culture. Results: 32 KRAS mutant patients were included in the study. Among them, 71.88% were men with an average age of 59 years, 97% were smokers or former smokers, G12C and G12V (28.13% each) were the most frequent KRAS mutant detected followed by G12D (12.5%). 34,38% of patients had partial response, 9,38% stable disease and 25% progression disease. Overall median progression-free survival was 3.4 months and the overall survival was 13.4 months. We found a significant correlation by Spearman test between HES1 and STAT3, CREB1 and LKB1, CREB1 and Src, CREB1 and STAT3, Src and STAT3, Src and YAP1, STAT3 and YAP1. Patients with high expresison of Src had a median PFS of 1.6 months compared to 4.1 months for those with low Src mRNA expression (HR= 2,469 CI 95%(1.110-5.495) p=0,0215). Patients with high expression of LKB1 had a longer median progression-free survival of 4.2 months compared to 0.7 months (HR=0,344 CI 95%(0,128-0,924) p=0,0259) for those who had low LKB1 expression. Finally, patients with low expression of CDCP1 had a longer median progression-free survival of 4 months compared to 0.7 months for those with high CDCP1 expression (HR=5,495; CI 95%(1,574-19.231) p=0,0025). Patients with high CDCP1 expression experienced a shorter overall survival of 3.2 months compared to 16.3 months for those with low CDCP1 expression (HR=0,97 (0,020-0,460) p=0,0005). Among patiens with evaluable LKB1 mRNA expression levels, those with high LKB1 expresion had a median overall survival for 19.4 months compard to only 1.1 months for those with low levels of LKB1 (HR= 0,097 (0,020-0,460) p= 0,0005) On the other hand, viability studies were carried out on 4 cell lines (A459, H23, Calu6 and 460), treating them with trametinib (MEK inhibitor), TPX0005 (Src/FAK inhibitor) and the combination of both. The combination was additive in the A549 cell line, and synergistic in the rest three cell lines (H23, Calu6 and H460). Western blot analysis demonstrated the inhibition of histone 3 phosphorylation by TPX0005 alone and when combined with trametinib in Calu 6, H23 and H460. Intriguingly, TPX0005 alone was able to abrogate histone 3 phosphorylation as soon as 2 hours after the cells were exposed to the treatment. The effect of the treatment on cellular morphology was also studied, TPX0005 causes the formation of binucleate and aberrant cells. Through immunofluorescence it was found TPX0005 blocked mitosis between the prophase and metaphase, while trametinib arrested the cells in the G1 phase. Conclusions: Non small cell lung cancer with a KRAS mutation, is an heterogeneous disease with an aggressive behavior. The correlations among the transcripts examined confirmed the biological rationale behind our study. We found a group of KRAS patients with better outcome based on the expression levels of Src, CDCP1 and LKB1. Combining trametinib with the Src/FAK inhibitor was synergistic in most of the KRAS mutant cell lines examined.