Strategies for rapid and reagent-less electrochemical detection of RPA products

Abstract

Avui en dia, hi ha la necessitat de desenvolupar un sistema per a la detecció d'ADN que sigui ràpid, simple, econòmic i reproduïble per al diagnòstic en diferents camps com malalties genètiques, detecció de patògens, medicina forense i medicina personalitzada.Els mètodes convencionals per a la detecció de seqüències d'ADN específiques es basen en assajos de seqüenciació directa o d'hibridació, essent aquest últim el més utilitzat en genosensors. Aquest mètode consisteix en l'ús de superfícies transductores modificades amb sondes d'ADN monocatenari, que reconeixen la seva seqüència complementària (diana) amb alta afinitat i especificitat.Una de les limitacions de l'aplicació d'aquests sensors a dispositius portàtils és la necessitat de la realització d'etapes posteriors a l'amplificació. Aquestes etapes inclouen la generació d'ADN monocatenari o la seva modificació amb un marcador abans de assolir la detecció.En aquest treball, es combina l'amplificació isotèrmica i l'ús d'encebadors modificats per simplificar les etapes necessàries per la detecció electroquímica d'ADN. Aquests encebadors, contenen una seqüència d'oligonucleòtids monocatenària unida a un espaiador de carboni, que bloqueja eficaçment l'elongació, abans de la seqüència del encebador. Per tant, el producte final està compost per un ADN de doble cadena flanquejat per dues cues d'ADN monocatenàries. Una de les cues es va utilitzar per hibridar a una sonda immobilitzada en la superfície i l'altra a una sonda marcada amb enzims o nanopartícules d'or. L'ús d'aquests encebadors modificats van permetre detectar l’ADN electroquímicament sense necessitat d'un tractament posterior a l'amplificació de la mostra, disminuint el temps d'assaig i presentant un enfocament més portable per ser aplicat en qualsevol situació.

Hoy en día, existe la necesidad de desarrollar un sistema para la detección de ADN que sea rápido, simple, económico y reproducible para el diagnóstico en diferentes campos como enfermedades genéticas, detección de patógenos, medicina forense y medicina personalizada.Los métodos convencionales para la detección de secuencias de ADN específicas se basan en ensayos de secuenciación directa o de hibridación, siendo este último el más utilizado en genosensores. Este método consiste en el uso de superficies transductoras modificadas con sondas de ADN monocatenario (ssDNA), que reconocen su secuencia complementaria (diana) con alta afinidad y especificidad.Una de las limitaciones de la aplicación de estos sensores a dispositivos portátiles es la necesidad de la realización de etapas posteriores a la amplificación. Estas etapas incluyen la generación de ADN monocatenario o su modificación con un marcador antes de pasar a la detección.En este trabajo, se combina la amplificación isotérmica y el uso de cebadores modificados para simplificar los pasos necesarios para la detección electroquímica de ADN. Estos cebadores, contienen una secuencia de oligonucleótidos monocatenaria unida a un espaciador de carbono, que bloquea eficazmente la elongación, antes de la secuencia del cebador. Por lo tanto, el producto final está compuesto por un ADN de doble cadena flanqueado por dos colas de ADN monocatenarias. Una de las colas se usó para hibridar a una sonda inmovilizada en la superficie y la otra a una sonda marcada con enzimas o nanopartículas de oro. El uso de estos cebadores modificados permitió detectar ADN electroquímicamente sin necesidad de un tratamiento posterior a la amplificación de la muestra, disminuyendo el tiempo de ensayo y presentando un enfoque más portable para ser aplicado en cualquier situación

Nowadays, there is a need to develop a rapid, simple, inexpensive and reliable DNA testing system for diagnosis in different fields such as genetic diseases, pathogens detection, forensics, and personalised medicine. Conventional methods for the detection of specific DNA sequences are based on direct sequencing or hybridisation assays, being this last one approach, the most widely used in genosensors. It consists on single-stranded DNA (ssDNA) tethered probes on a transducer surface, which recognises its complementary sequence (target) with high affinity and specificity. One of the limitations of these DNA sensors to apply them for a portable molecular diagnostics devices is the multi-step procedures needed, since post-amplification treatment is necessary for its detection by generating ssDNA or adding a hapten labelling. In this work, the isothermal amplification and modified tailed primers to simplify the steps required for the electrochemical DNA detection are combined. Modified tailed primers are based on a single stranded oligonucleotide sequence linked to a carbon spacer, which effectively blocks elongation, prior to the primer sequence. Thus, resulting in an amplicon with a duplex flanked by two single stranded DNA tails. One of the tails was used to hybridise to a surface immobilised probe and the other to an enzyme or gold nanoparticles labelled reporter probe. Using these modified primers allowed us to detect DNA electrochemically without any need for post-amplification sample treatment decreasing the assay time and presenting an approach that can facilely find application at the point of need.