Study of extracellular matrix remodeling and the role of periostin b during zebrafish heart regeneration

Abstract

Adult zebrafish (Danio rerio), in contrast to mammals, are able to regenerate their hearts in response to injury or experimental amputation. Our understanding of the cellular and molecular bases that underlie this process, although fragmentary, has increased significantly over the last years. However, the role of the extracellular matrix (ECM) during zebrafish heart regeneration has been comparatively rarely explored. A better understanding of all the mechanisms underlying this complex process would help developing strategies to regenerate the human heart. With this aim, here, we set out to characterize the ECM protein composition in adult zebrafish hearts, whether it changed during the regenerative response, and the role of the matricellular protein periostin b.

For this purpose, in the first part of the current thesis, we established a decellularization protocol of adult zebrafish ventricles that significantly enriched the yield of ECM proteins. We then performed proteomic analyses of decellularized control hearts and at different times of regeneration. Our results show a dynamic change in ECM protein composition, most evident at the earliest (7 days post-amputation) time-point analyzed. Regeneration associated with sharp increases in specific ECM proteins, and with an overall decrease in collagens and cytoskeletal proteins. We finally tested by atomic force microscopy that the changes in ECM composition translated to decreased ECM stiffness. Our cumulative results identify changes in the protein composition and mechanical properties of the zebrafish heart ECM during regeneration.

In the second part of the current thesis, we have examined the role of periostin b (postnb) during zebrafish heart regeneration. We found that postnb was abundant in the injury of amputated zebrafish ventricles, and we designed two strategies to suppress postnb during regeneration: 1) a shRNA transgenic knock-down, and 2) a CRISPR/Cas9 postnb-/- zebrafish. Knock-down and knock-out fishes did not exhibit any evident developmental defects, but showed a lack complete cardiac regeneration after amputation. The absence of postnb did not have any effect on leukocyte recruitment, matrix metalloproteinase activation or revascularization after amputation. However, postnb-/- zebrafish developed a softer cardiac ECM due to a reduction of collagen cross- linking, and showed an increase of cardiomyocyte proliferation and a decrease on cardiomyocyte cell death after amputation. The stiffness control by postnb seem to be important to correctly modulate stiffness for a complete cardiac regeneration. Stiffness analysis toguether with proliferation analysis suggest that postnb is needed to increase the stiffness in the injury border to instruct cardiomyocytes to stop proliferating and migrate to the injury site.

El peix zebra adult (Danio rerio) és capaç, contràriament als mamífers, de regenerar el seu cor en resposta a una lesió o amputació experimental. La comprensió de les bases cel·lulars i moleculars subjacents a aquest procés ha augmentat significativament en els últims anys, encara que segueix sent fragmentària. Tot i així, el paper de la matriu extracel·lular (MEC) durant la regeneració cardíaca del peix zebra ha estat rarament explorat. Una millor comprensió de tots els mecanismes subjacents a aquest complex procés podria ajudar a desenvolupar estratègies per a regenerar el cor humà. Amb aquest objectiu, es va proposar caracteritzar la composició proteica de la MEC en cors de peix zebra adults, els possibles canvis existents durant la resposta regenerativa, i el paper de la proteïna matricel·lular periostin b (postnb).

A aquest efecte, a la primera part de la present tesis, es va establir un protocol de descel·lularització de ventricles de peix zebra adults, que va aconseguir un enriquiment significatiu en el contingut en proteïnes de la MEC. A continuació, es va realitzar un anàlisi proteòmics de cors control descel·lularitzats i en diferents moments del procés de regeneració per avaluar els canvis proteics. Els nostres resultats mostren un canvi dinàmic en la composició proteica de la MEC, més evident a temps més inicial del procés de regeneració analitzat (7 dies després de l'amputació). Així, la regeneració cardíaca es va associar a un increment de proteïnes especifiques de la MEC, i a una reducció generalitzada de col·làgens i proteïnes citoesquelètiques. Finalment, es va analitzar per Atomic Force Microscopy els canvis en la duresa de la MEC produïts per aquests canvis observats de composició. El nostre conjunt de resultats identifiquen canvis en la composició proteica i les propietats mecàniques de la MEC cardíaca durant la regeneració.

A la segona part de la present tesis, es va examinar el paper de la periostin b (postnb) durant la regeneració cardíaca del peix zebra. La seva presència era abundant a la ferida de ventricles amputats, i es van dissenyar dues estratègies per a suprimir la postnb durant la regeneració: 1) un knock-down (KD) mitjançant shRNAs, i 2) un knock- out (KO) per CRISPR/Cas9. Ni la línia KD ni la KO exhibien cap defecte del desenvolupament, però demostraven una clara deficiència en el procés de regeneració després de l’amputació del ventricle. La absència de la postnb no va demostrar cap efecte sobre el reclutament de leucòcits, l’activació de les metaloproteases de matriu (MMP), o la revascularització després de l’amputació. Tot i així, els peixos postnb-/- van desenvolupar una MEC més tova degut a una reducció del cross-linking del col·lagen. Alhora, van demostrar un increment de la proliferació i una reducció de l’apoptosi dels cardiomiòcits després de l’amputació. El control de la duresa de la MEC efectuat per la postnb sembla ser important per modular correctament aquesta propietat mecànica per a una regeneració cardíaca completa. Els anàlisis de duresa conjuntament amb els anàlisis de proliferació suggereixen que la postnb és necessària per a un increment de la duresa en la vora de la ferida. Així, seria requerida per a instruir als cardiomiòcits per parar de proliferar i migrar cap a la ferida.