Immunomodulation by mesenchymal stem cells for myocardial regeneration: cellular mechanisms and extracellular vesicles

Abstract

Les respostes immunològiques descontrolades obstaculitzen la regeneració de teixits danyats i el transplantament d’òrgans, i provoquen al·lèrgies i trastorns autoimmunitaris, causant morbiditat i mortalitat. Un d’aquests casos és el dany causat per la isquèmia-reperfusió (IRI) que ocorre en un infart de miocardi (MI). El IRI provoca una intensa inflamació, que, tot i ser necessària per iniciar la neteja de les cèl·lules mortes i activar els mecanismes de reparació cardíaca, cal aturar a temps per minimitzar el dany tissular post-MI i el remodelat miocardíac, que pot esdevenir en insuficiència cardíaca. En aquest context, les cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) es postulen com una estratègia terapèutica prometedora per contrarestar aquestes respostes immunitàries no desitjades. Tot i tenir una curta vida després de la seva administració in vivo, les MSCs han demostrat ser beneficioses tant per al tractament de patologies d’arrel immunitària com per la promoció de la regeneració cardíaca en models preclínics de MI. L’objectiu d’aquesta tesi és doncs desxifrar quins són els mecanismes cel·lulars i paracrins que capaciten les MSCs per tenir un efecte immunosupressor i regenerador a llarg termini. La hipòtesi de treball és que les MSCs aconsegueixen la generació d’ambients reguladors amb un efecte durador mitjançant la modulació de les cèl·lules immunes de l’hoste, mentre que la secreció de factors paracrins els permet tenir una acció deslocalitzada i promoure alhora la regeneració endògena. Amb aquesta idea, en primer lloc hem estudiat la influència de les MSCs en la biologia dels monòcits, com a part de la immunitat innata. Hem confirmat el paper de les MSCs en la modulació dels monòcits vers una polarització reparadora M2, descrivint la activitat enzimàtica adenosinèrgica extracel·lular com una funcionalitat afegida. Els monòcits condicionats amb MSCs mantenen l’expressió de CD39, mentre que s’indueix la de CD73, responsable de la hidròlisi seqüencial de ATP/ADP a AMP i adenosina, respectivament, per passar de l’ambient pro-inflamatori promogut per ATP extracel·lular a la regulació anti-inflamatòria de l’adenosina. Per altra banda, les MSCs també modulen la resposta immune adaptativa, ja que hem observat la supressió de la proliferació policlonal i resposta inflamatòria de limfòcits al·logènics. Pel que fa a la activitat paracrina de les MSCs, hem identificat les vesícules extracel·lulars (EVs) com un des components immunosupressors secretats per les MSCs. Concretament, hem demostrat la importància d’un aïllament acurat de les MSC-EVs per evidenciar el seu potencial immunosupressor, que es pot aconseguir eficientment mitjançant la cromatografia d’exclusió per mida (SEC). Finalment, aquest coneixement ens ha permès dissenyar un nou constructe format per una matriu biocompatible 3D de bioenginyeria cardíaca integrada amb MSC-EVs per al tractament local del MI i promoure regeneració cardíaca. La validació in vitro d’aquest constructe va reforçar la importància de la secreció de EVs com un mecanisme de les MSCs per modular el sistema immunitari i fomentar els processos de reparació endògena, donat que les MSC-EVs poden reclutar activament cèl·lules pro-regeneradores. Els nostres resultats aporten nous mecanismes a aprofitar per generar nous productes terapèutics dirigits, innovadors i fàcilment translacionals.

Exacerbated immune responses hamper regeneration of injured tissues and organ transplantation, and lead to allergies and autoimmune disorders causing morbidity and mortality. One of these scenarios is the ischaemia-reperfusion injury (IRI) occurring upon myocardial infarction (MI). IRI triggers an intense inflammatory response that is initially necessary for dead cell clearance and the induction of cardiac repair, but its timely suppression is critical to minimize post-MI tissue damage, cardiac remodelling and ultimately, heart failure. In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) are promising as a therapeutic strategy to counteract such unwanted immune responses, as MSC administration has a beneficial effect for the treatment of immune-related disorders and promote cardiac repair in preclinical models of MI, albeit their short lifespan after in vivo infusion. The aim of this thesis is to decipher the cellular and paracrine mechanisms that would help explain MSCs’ long-lasting immunosuppressive and regenerative effects. The working hypothesis is that these could be mediated by the modulation of the host’s immune cells for the generation of regulatory environments and enduring effect, in addition to the secretion of paracrine factors for a delocalized action that would also foster endogenous repair. With this in mind, we first studied MSC’s influence on monocytes as part of the innate immune response. We confirmed MSCs’ modulation of monocytes towards a wound-healing M2-like polarization, but with the added functionality of an active extracellular adenosinergic enzymatic activity. MSC-conditioned monocytes maintained CD39 and induced CD73 expression, which are responsible of the sequential hydrolysis of ATP/ADP to AMP and to Adenosine, respectively, to shift the pro-inflammatory milieu induced by extracellular ATP to the anti-inflammatory regulation by Adenosine. On the other side, MSCs also modulate the adaptive immune response, as we observed the immunosuppression of allogeneic lymphocyte polyclonal proliferation and inflammatory cytokine release. Regarding the paracrine activity of MSCs, we could identify extracellular vesicles (EVs) as one of the active components of MSC’s immunosuppressive secreted factors. Specifically, we demonstrated the importance of accurate isolation of MSC-EVs to unravel their immunosuppressive functionality, which can be efficiently performed by size-exclusion chromatography (SEC). Finally, this knowledge made us design a novel construct composed of MSC-EVs embedded in a biocompatible three-dimensional engineered cardiac scaffold, envisioned for the local treatment of MI to foster cardiac repair. Its in vitro validation reinforced EV secretion as an important mechanism of MSCs to both modulate the immune system and foster endogenous repair, as they could actively recruit pro-regenerative cells. Our findings unravel new mechanisms for the engineering of innovative, targeted and off-the-shelf therapeutic products.