Regulació del transportador de nucleòsids d'alta afinitat hCNT3 per proteïnes d'interacció

Abstract

Els transportadors de nucleòsids pertanyen a les famílies gèniques SLC28 i SLC29 que codifiquen pels transportadors de nucleòsids concentratius (hCNTs) i transportadors de nucleòsids equilibratius (hENTs), respectivament. La família dels hENTs inclou quatre membres: hENT1, hENT2, hENT3 i hENT4. Aquests realitzen el transport de nucleòsids o dels anàlegs derivats de nucleòsids a favor de gradient de concentració, són independents de sodi i poden transportar bidireccionalment. Les proteïnes hENT1 i hENT2 transporten purines i pirimidines amb baixa afinitat. La família dels hCNTs està formada per tres membres: hCNT1, 2 i 3. hCNT1 transloca pirimidines i hCNT2 purines i uridina mitjançant un mecanisme unidireccional amb una estequiometria d’un catió de sodi per cada nucleòsid transportat. hCNT3 presenta una àmplia selectivitat de substrat transportant tant nucleòsids purínics com pirimidínics, així com els seus anàlegs, inclosos alguns derivats de nucleobases com les tiopurines amb una estequiometria de 2 sodis per cada nucleòsid. A més, sabem que les proteïnes CNTs d’eucariotes han incorporat evolutivament un domini N-terminal que no està present als procariotes, encara que aquests ortòlegs més primitius són totalment funcionals. D’això es dedueix que aquesta zona N-terminal no és essencial per a l’activitat transportadora però sí que sembla que conté zones reguladores, tal i com s’ha començat a comprovar. Per aquest motiu es pot hipotetitzar que el domini N-terminal d’hCNT3 pot ser rellevant per tal de comprendre totes aquelles funcions associades a aquesta proteïna transportadora, no necessàriament vinculades estrictament a la seva activitat com a transportador. Aquesta tesi s’ha estructurat en dos grans blocs, un que fa referència a l’estudi de les possibles proteïnes d’unió amb el transportador, conferint-li així aquestes noves funcions reguladores que es postulen gràcies aquest nou domini. I l’altre bloc referent a l’estudi de la pròpia funció transportadora de la proteïna, específicament del transport d’acadesina (AICAR). Una aproximació proteòmica amb el domini N-terminal d’hCNT3 ha permès identificar proteïnes com Galectina-4 (Gal-4), l’Adenosina Quinasa (ADK) com a possibles proteïnes d’interacció amb hCNT3, utilitzant com a font de proteïnes un homogenat de còlon, per Gal-4 i un extracte proteic de mostres de pacients amb Leucèmia Limfàtica Crònica (LLC) per l’ADK. S’ha pogut veure com el transportador hCNT3 interacciona amb la proteïna Gal-4 promovent el seu tràfic cap a la membrana plasmàtica en la línia cel·lular HT-29. Paral·lelament també s’ha comprovat que hCNT3 interacciona amb ADK, aquesta interacció provoca un canvi en l’eficiència per transportar adenosina, per tant, el transportador podria regular els nivells d’adenosina extracel·lulars. A més, s’ha estudiat el paper dels hCNT en la captació d’acadesina (AICAR), un anàleg de nucleòsid que s’ha descrit que pot inhibir la proliferació cel·lular i induir apoptosi a diferents tipus de tumors i leucèmies, entre elles la LLC, model el qual es va identificar la interacció amb ADK. En la present tesi, s’ha descrit que els transportadors responsables de la internalització d’AICAR són hCNT3 i hENT1. Posteriorment es va analitzar si el fet que aquest fàrmac tingués dues vies d’entrada tenia algun efecte fisiològic per la cèl·lula. Ja que una de les vies esdevenia més eficient al interaccionar amb ADK, enzim que fosforila AICAR a AICA ribotide (ZMP) per ser actiu. Per tant, s’esperava era que el transport d’AICAR per hCNT3 es traduís en més activació d’AMPK ja que hCNT3 estaria interaccionant amb l’ADK. No obstant, es va observar que l’efecte inductor de l’AMPK l’exerceix majoritàriament l’AICAR que s’interioritza per hENT1. S’ha de tenir en compte que l’aportació d’hCNT3 al model utilitzat és molt minoritària, amb la qual cosa es necessitarien més estudis per comprendre el mecanisme d’acció d’AICAR. Podríem dir que en aquest treball s’han generat les primeres evidències que demostrarien que el transportador hCNT3 pot interaccionar amb altres proteïnes, adquirint noves funcions per la cèl·lula o per acabar de madurar i poder realitzar la seva funció.

Two gene families are implicated in the uptake of nucleosides and nucleoside analogs into cells, SCL28 and SLC29. The former encodes hCNT1, hCNT2, and hCNT3 proteins. They translocate nucleosides in a Na(+) coupled manner with high affinity and some substrate selectivity, being hCNT1 and hCNT2 pyrimidine- and purine-preferring, respectively, and hCNT3 a broad selectivity transporter. SLC29 genes encode four members, being hENT1 and hENT2 the only two which are unequivocally implicated in the translocation of nucleosides and nucleobases (the latter mostly via hENT2) at the cell plasma membrane. The hCNT3 transporter and the other members of the SLC28 gene family have a prominent N-terminal domain that is absent in prokaryotic CNTs this domain fulfils the biochemical requirements for being a hub for protein–protein interactions. Moreover, this fragment of the protein is responsible for hCNT3 polarized insertion into the plasma membrane and contains amino acid residues implicated in the kinetics of hCNT3 trafficking. In a recent GST-pull down approach using the N-terminus tail of the hCNT3 transporter as a bait and protein extracts from healthy human colon pool lysate or Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL) primary cells as prey, we have been able to selectively precipitate Gal-4 and ADK, respectively. We validated biochemically the interaction Gal-4-hCNT3 and the biological significance was that this protein is a regulator of hCNT3 trafficking and retention at the plasma membrane. Regarding ADK, we also found the first evidence that hCNT3 decrease its KM value for adenosine when the transporter is interacting with ADK. Suggesting that the transporter could be, at least in part, implicated in the regulation of extracellular adenosine levels. Finally, we identified hCNT3 and hENT1 as the responsibles for AICAR uptake, an analog of adenosine monophosphate, which induce apoptosis in B-CLL cells. Because we identified ADK to increase hCNT3 efficiency in adenosine uptake, we suspected that this would be the main entrance for AICAR. However, we found that the AMPK phosphorylation produced by AICAR was mainly through hENT1 transport. We should keep in mind that the cellular model used for these experiments showed a low hCNT3 activity. So, further studies are needed to understand the mechanisms of AICAR.