Structural and kinetic features of three human aldehyde dehydrogenases, ALDH1A1, ALDH1A2 and ALDH1A3, active in retinoic acid biosynthesis

Abstract

La superfamília de les aldehid deshidrogenases (ALDH) comprèn un elevat nombre de proteïnes dimèriques i tetramèriques, amb un pes molecular aproximat de 55 kDa per subunitat i amb diferents localitzacions cel·lulars (citoplasmàtica, mitocondrial i reticle endoplasmàtic). Les ALDH inclouen un grup evolutivament relacionat d’enzims dependents de NAD(P)+, que catalitzen l’oxidació d’un ampli espectre de substrats aldehídics, generats a partir de diversos precursors endògens i exògens, als seus corresponents àcids carboxílics. Aquesta Tesi Doctoral forma part dels estudis estructurals i funcionals realitzats pel nostre grup de recerca sobre el paper de les oxidoreductases en el metabolisme dels retinoides. En aquests estudis s’han determinat les seves constants catalítiques amb aquests substrats, després de la solubilització amb albúmina sèrica bovina i mitjançant l’anàlisi d’activitat utilitzant una metodologia basada en HPLC. La Tesi pretén realitzar una anàlisi estructural i cinètica, exhaustiva i robusta, sobre els enzims humans implicats en l’oxidació irreversible del retinaldehid a àcid retinoic. La primera part tracta sobre la comparació de la butxaca d’unió al substrat dels enzims humans ALDH1A, els quals van mostrar topologies similars i volums decreixents en les seves butxaques d’unió al substrat. Els tres enzims van ser subclonats, expressats i purificats en la seva forma soluble i activa. Pel que fa als valors de kcat/Km amb alcanals i alquenals, ALDH1A3 és l’enzim que presenta els valors més baixos per a tots els substrats, suggerint un paper moderat en l’oxidació fisiològica d’aquests aldehids. Els valors de kcat/Km d’ALDH1A1 i ALDH1A2 indiquen un paper potencialment important en la transformació d’aquests aldehids, encara que amb una especificitat de substrat lleugerament diferent. Per mesurar l’activitat de les ALDH1A amb un substrat fisiològic, el retinal, es va realitzar una optimització de la metodologia d’extracció en solvents orgànics. A partir dels mètodes avaluats, la barreja hexà/dioxà/isopropanol va permetre recuperar aproximadament el 100% de retinal i d’àcid retinoic. Els tres enzims van ser actius amb els dos isòmers del retinaldehid i van seguir una cinètica de Michaelis-Menten, amb valors de Km en el rang micromolar. En relació als valors de kcat, aquests van ser més elevats per al tot-trans-retinal (ALDH1A2 i ALDH1A3) o similar per a ambdós isòmers (ALDH1A1). ALDH1A3 va ser el millor enzim en termes d’eficiència catalítica, seguit per ALDH1A2. A més, s’ha descrit per primera vegada l’activitat enzimàtica dels enzims ALDH1A amb apo-β-carotenals, derivats de la digestió excèntrica del β-carotè. La segona part d’aquest treball es centra en el paper d’alguns residus específics en les propietats cinètiques dels enzims ALDH1A. Es va realitzar una mutagènesi dirigida, a partir de diferències estructurals en residus seleccionats de la butxaca d’unió al substrat. La substitució L114P en ALDH1A1 ha estat seleccionada per fer aquesta part de l’estructura més similar a ALDH1A2. Per altra banda, en ALDH1A2, es van realitzar quatre canvis de residus contigus, N475G, A476V, L477V i N478S, per imitar l'estructura d’ALDH1A1. Al mutant ALDH1A1 L114P, els valors de Km per a l’hexanal i el citral es van incrementar entre 50 i 100 vegades, en relació als valors d’ALDH1A1 salvatge. Per contra, l’ALDH1A2 mutant va mostrar una disminució de 50 vegades en el valor de la Km per al citral. A més, la disminució de 5 vegades en el valor de la kcat, va provocar que l’eficiència catalítica de l’ALDH1A2 mutant per al citral s’aproximés a l’observada a l’ALDH1A1 salvatge. En relació a les cinètiques amb els isòmers del retinal, els mutants no van mostrar diferències significatives amb els respectius enzims no mutats, de manera que els residus alterats no són crítics en l’especificitat per al retinal. Finalment, es van realitzar estudis d’inhibició dels enzims ALDH1A per trobar inhibidors nous, potents i selectius. Per primera vegada, s’han descrit alguns compostos que tenen efecte inhibidor sobre les ALDH1A. Aquests resultats preliminars semblen molt prometedors per desenvolupar nous farmacòfors en l’àmbit del disseny de fàrmacs basat en l’estructura.

The aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily comprises a large number of dimeric and tetrameric proteins with a subunit molecular weight of approximately 55 kDa and different subcellular localization (cytoplasm, mitochondria and endoplasmic reticulum). ALDHs include a cluster of evolutionarily related NAD(P)+-dependent enzymes catalyzing the oxidation of a wide spectrum of aldehydic substrates, generated from various endogenous and exogenous precursors, to their corresponding carboxylic acids. The Thesis dissertation is a part of the structural and functional studies performed by our group on the role of oxidoreductases in retinoid metabolism, where their catalytic constants with retinoids were determined after solubilization with bovine serum albumin and by activity analysis using an HPLC-based methodology. The Thesis aims to perform an exhaustive and robust structural and kinetic analysis on the human enzymes involved in the irreversible oxidation of retinaldehyde to retinoic acid. The first part deals with a comparison of the substrate-binding pocket of the human ALDH1A enzymes, which exhibited similar topologies and decreasing volumes in their substrate-binding pockets. The three enzymes were subcloned, overexpressed and affinity purified in their soluble and active form. Their enzymatic activity was characterized with alkanals and alkenals as substrates. In terms of kcat/Km values, ALDH1A3 exhibits the lowest values for all substrates, suggesting a moderate role in the physiological oxidation of these aldehydes. The kcat/Km values of ALDH1A1 and ALDH1A2 indicate a potentially major role in the transformation of these substrates with slightly different substrate specificity. In order to measure activity with a physiological substrate of ALDH1As, retinaldehyde, an optimization of the solvent extraction methodology was carried out. From the evaluated methods, extraction with hexane/dioxane/isopropanol was chosen, since it was the most efficient in recovering retinaldehyde and retinoic acid from the activity buffer, with a yield near 100%. The three enzymes were active with two retinaldehyde isomers and followed Michaelis-Menten kinetics, with Km values in the micromolar range. Related to the kcat values, they were higher for the all-trans isomer (ALDH1A2 and ALDH1A3) or similar for the two isomers (ALDH1A1). ALDH1A3 was the best enzyme in terms of catalytic efficiency, followed by ALDH1A2. Moreover, the activity of ALDH1A enzymes with apo-β-carotenals, derived from the eccentric cleavage of β-carotene, was described for the first time. The second part of this work is centered on the role of specific residues in the kinetic properties of ALDH1A enzymes. We performed site-directed mutagenesis, based on structural differences of selected residues from the substrate-binding pocket. The substitution L114P in ALDH1A1 was selected to make this part of the structure more similar to that of ALDH1A2. Likewise, in ALDH1A2, four contiguous residue changes, N475G, A476V, L477V and N478S were made to mimic the structure of ALDH1A1. In the ALDH1A1 L114P mutant, the Km values for hexanal and citral were increased by 50-100 fold related to those of the wild-type ALDH1A1. Conversely, the mutant ALDH1A2 exhibited a 50-fold decrease in the Km value for citral. In addition, the 5-fold decrease in the kcat value made the catalytic efficiency of mutant ALDH1A2 for citral to become similar to that of wild-type ALDH1A1. In regard to kinetics with retinaldehyde isomers, the mutants did not show significant differences with the respective wild-type forms, thus the mutated residues are not critical for retinaldehyde specificity. Finally, inhibition studies of ALDH1A enzymes were performed in order to find novel, potent and selective inhibitors against ALDH1A1, ALDH1A2 and ALDH1A3. For the first time, we described some compounds as ALDH1A inhibitors and these preliminary results appear to be very promising to develop new pharmacophores by using structure-based drug design.