Noves aproximacions terapèutiques en la Distrofia Muscular de Duchenne i validació d'estratègies diagnòstiques en les malalties neuromusculars pediàtriques

Abstract

Els trastorns neuromusculars pediàtrics són malalties minoritàries causades per un gran nombre de gens, molts d’ells de gran mida i d’estructura complexa, fet que dificulta enormement el diagnòstic molecular i el disseny de noves estratègies terapèutiques. Alhora son malalties sovint multisistèmiques, que involucren a molts professionals, pel que el maneig d’aquests pacients és també complex. Davant aquest gran repte, aquesta tesi s’ha centrat en dos fites principals. Per una banda, en analitzar l’abordatge de dues aproximacions terapèutiques per a la DMD, i, en segon lloc, en la optimització de les eines diagnòstiques pels pacients amb malalties neuromusculars. Les dues aproximacions terapèutiques per a la DMD són: - Aprofundir en el coneixement de l’efecte dels estrògens en el múscul esquelètic tractant el model murí deficient en distrofina mitjançant la inserció subcutània d’un pellet de 17β-Estradiol (E2) durant un mes. Aquest tractament ens ha permès demostrar l’efecte beneficiós de l’E2 reduint els nivells del marcador de dany muscular, creatina quinasa (CK) i disminuint les acumulacions de calci intracel·lular, segurament actuant com a estabilitzador de membrana. A més l’estudi de expressió gènica diferencials ens revela que l’E2 genera la sobreexpressió de gens relacionats amb la miogènesi com la miogenina, la utrofina o els marcadors de cèl·lules satèl·lit Pax7 i MyoD. A més, genera la sobreexpressió del receptor de neurotrofines de baixa afinitat p75NTR. Aquest receptor s’expressa en cèl·lules satèl·lit i a la membrana sarcoplasmàtica de fibres en regeneració. Tot i no haver pogut determinar quin lligand actua sobre p75NTR, es postula que es tracta de NGF, proteïna que és degradada per la metal·loproteasa MMP-9 (sobreexpressada també amb l’E2). La modulació del receptor de p75NTR per mitjà del fàrmac agonista parcial LM11A-31, tot i reduir els nivells de CK, no aconsegueix els mateixos efectes que l’E2. En resum, sembla ser que l’E2 es troba promovent la supervivència cel·lular en el múscul esquelètic per mitjà de la modulació de la via PI3K/Akt. - Comprovar l’eficàcia del fàrmac PTC-124 sobre les mutacions nonsense en el model murí mdx, restablint l’expressió de distrofina per mitjà tres injeccions diàries durant dues setmanes. No s’ha pogut observar increment de la proteïna Distrofina en els animals tractats amb el fàrmac però si en aquells injectats amb el vehicle de dissolució, el DMSO. En un futur, s’haurà d’analitzar els efecte del DMSO sobre el múscul esquelètic en profunditat. Es va hipotetitzar que la no funció es podia deure a que el PTC-124 no arribava al seu teixit diana, el múscul esquelètic. Per això, es va plantejar l’ús de nanopartícules mesoporoses de sílice (MSNs) com a vehicles d’alliberament del fàrmac al teixit diana, demostrant que era una bona estratègia pel tropisme de les nanopartícules pel múscul inflamat. I l’aproximació diagnòstica pels pacients amb malalties neuromusculars pediàtriques, va ser: - Analitzar el rendiment diagnòstic de noves tècniques de seqüenciació masiva (exoma complet i exoma clínic) en pacients amb trastorns neuromusculars pediàtrics. Mitjançant aquesta aproximació hem pogut demostrar que el rendiment diagnòstic d’aquestes tècniques depèn i precisa del diagnòstic clínic previ mitjançant les dades clíniques, l’electromiografia, la biòpsia muscular i la ressonància magnètica muscular. Com més clar sigui aquest diagnòstic previ, més possibilitats hi ha de trobar la causa genètica. En aquestes condicions, l’anàlisi mitjançant exoma clínic (panell) ha resultat tenir un millor rendiment que l’exoma complet. A més, la validació funcional de les variants considerades de significat incert (VUS) és necessària per la confirmació dels diagnòstics.

Pediatric neuromuscular disorders are minority diseases caused by a large number of genes, many of them of large size and complex structure, which makes difficult the molecular diagnosis and the design of new therapeutic strategies. So, this thesis has focused on two main goals: (1) analyzing the approach of two therapeutic approaches to DMD, and (2) optimizing diagnostic tools for patients with neuromuscular diseases. The two therapeutic approaches are: - To learn more about the effect of estrogen on skeletal muscle by treating the dystrophin-deficient murine model. It has been shown the effect of E2 by reducing the levels of creatine kinase and decreasing intracellular calcium accumulation, acting as a membrane stabilizer. In addition, the study of differential gene expression reveals that E2 promotes overexpression of genes related to myogenesis and satellite cells. Also, it generates overexpression of the low-affinity neurotrophin receptor, p75NTR. This is expressed in satellite cells and in the sarcoplasmic membrane of regeneration fibers. We postulate that its ligand is NGF, a protein degraded by MMP-9 (overexpressed also with E2). So, it seems that E2 is promoting cell survival in skeletal muscle. - To test the efficacy of the PTC124 drug on nonsense mutations in the mdx model, which restores the expression of dystrophin. There was an increase in protein levels in DMSO-injected animals but not in those injected with PTC124. We hypothesize that the non-functionality could be because PTC-124 did not reach its target tissue. For this reason, mesoporous silica nanoparticles were used, demonstrating that it was a good strategy due to its tropism to inflamed muscle, but their effect was not observed in protein levels. The diagnostic approach for patients with pediatric neuromuscular diseases was: - To analyze the diagnostic performance of next-generation sequencing (Whole-Exome Sequencing (WES) and Gene-panel sequencing) in these patients. Through this approach we have been able to show that the diagnostic performance of these techniques depends on a previously defined clinical phenotype. In these conditions, Gene-Panel analysis has resulted in a better performance than WES. In addition, the functional validation of the variants considered of uncertain significance is necessary for the diagnostic confirmation.