ApoE4 pathology in Alzheimer’s disease from the perspective of organelle dysfunction in astrocytes

Abstract

La enfermedad de Alzheimer es la forma mas común de demencia en edades avanzadas, la cual afecta a 40 millones de personas alrededor del mundo. Es una enfermedad compleja que afecta no solo a neuronas, sino también a astrocitos. La Apolipoproteína E4 (ApoE4) ha sido descrita como el factor de riesgo genético más importante de la forma esporádica de la enfermedad y además, los astrocitos son los principales secretores de esta. La investigación sobre los mecanismos patogénicos causados por esta apolipoproteína está centrada en su rol extracelular. Por el contrario, nosotros analizamos las desregulaciones intracelulares que causa la ApoE4. En nuestro estudio, nos centramos en 2 principales procesos fisiológicos alterados en la enfermedad de Alzheimer: la señalización de calcio y las funciones mitocondriales. Utilizamos como modelo celular, astrocitos inmortalizados que expresan la forma humana ApoE3 (no asociada a ninguna patología) o la ApoE4. Utilizando indicadores de calcio fluorescentes y la técnica de Imagen de Calcio, determinamos que los astrocitos ApoE4 tienen alteraciones de la homeostasis de calcio, ya que presentan menores niveles de calcio intracelular basal pero mayores señales de calcio inducidas por estímulos purinérgicos en comparación con los astrocitos ApoE3. Una mayor actividad de la V-ATPasa y por lo tanto, una mayor entrada de calcio al lisosoma en los astrocitos ApoE4 explica estas alteraciones. Además, la salida de calcio lisosomal después de la activación de receptores purinérgicos es seguida por una mayor movilización de calcio del retículo endoplásmico en los astrocitos ApoE4 comparados con los ApoE3. La entrada de calcio extracelular es similar en ambos tipos celulares. Nuestros estudios también demuestran que la falta de lipoproteínas en el medio extracelular aumenta la magnitud de las respuestas de calcio inducidas por receptores purinérgicos en los astrocitos ApoE3, ya que la entrada de calcio extracelular amplifica la liberación del calcio lisosomal en estas células. Esta característica se pierde en las células ApoE4, en las cuales la magnitud de las respuestas de calcio no se ve afectada por las lipoproteínas extracelulares. Por otro lado, describimos alteraciones en las dinámicas mitocondriales determinadas por microscopia a tiempo real y el marcaje fluorescente de mitocondrias. En particular, las mitocondrias de células ApoE4 no realizan fisión después de la inhibición de la fosforilación oxidativa mitocondrial, mientras que las mitocondrias de los astrocitos ApoE3 si la realizan. Asimismo, los astrocitos ApoE4 tienen un incremento en la movilidad mitocondrial, una reducción de Parkina, proteína involucrada en la mitofagia y una reducción del ADN mitocondrial en comparación con los astrocitos ApoE3. En resumen, demostramos por primera vez que la ApoE4 endógena altera la señalización del calcio y las funciones mitocondriales en astrocitos. Teniendo en cuenta que la ApoE4 se expresa a lo largo de toda la vida de los individuos, estas alteraciones astrocíticas podrían aparecer en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer. Para avanzar en la detección de estas primeras etapas de la patología, y ya que las proteínas del líquido cefalorraquídeo reflejan las funcionalidad de las células cerebrales, nosotros hemos identificado un grupo de proteínas astrocíticas presentes en este líquido relacionadas con la enfermedad de Alzheimer y que proponemos como firma funcional astrocítica. Esta firma esta compuesta de las proteínas S100B, ApoE, prostaglandina D2 sintetasa, cistatina 3, proteína integral de membrana 2C y clusterina. En general, la ApoE4 endógena altera las funciones de los astrocitos, un fenómeno que puede contribuir a la enfermedad de Alzheimer, además de a su detección a través de biomarcadores del líquido cefalorraquídeo.

Alzheimer’s disease is the most common form of dementia in advanced ages affecting more than 40 million people around the world. It is a complex disease that affects not only neurons but also astrocytes. Apolipoprotein E4 (ApoE4) has been described as the most important genetic risk factor for the sporadic form of the disease and interestingly, astrocytes are its main secretors. The research about its pathogenic mechanisms has mainly focused on its extracellular role. On the contrary, we analysed the dysregulations that endogenous intracellular ApoE4 causes on astrocytes. We focused on 2 principal physiological processes altered in Alzheimer’s disease: calcium signalling and mitochondrial functions. As cellular model, we used immortalized astrocytes that express human ApoE3 (non-associated with any pathology) or ApoE4. Using fluorescent calcium indicators and the technique of Calcium Imaging, we determined that ApoE4 astrocytes have altered calcium homeostasis as they have lower basal intracellular calcium levels but higher purinergic-induced calcium signals compared to ApoE3 astrocytes. A high V-ATPase activity, and hence, higher lysosomal calcium uptake in ApoE4 astrocytes explains these alterations. Moreover, lysosomal calcium release after purinergic receptor activation is followed by higher endoplasmic reticulum (ER) calcium mobilization in ApoE4 than in ApoE3 astrocytes. Extracellular calcium entry is similar in both cell types. Our studies also demonstrated that the lack of lipoproteins in the extracellular medium upregulates the magnitude of purinergic-elicited calcium responses in ApoE3 astrocytes, as extracellular calcium entry amplifies lysosomal calcium release. This feature is missing in ApoE4 astrocytes being the magnitude of calcium responses unaffected by extracellular lipoproteins. On the other hand, we described alterations in mitochondrial dynamics determined by real-time microscopy and fluorescent mitochondria labelling. In particular, ApoE4 cell mitochondria do not perform fission after inhibition of mitochondrial oxidative phosphorylation whereas ApoE3 astrocyte mitochondria perform it. In addition, ApoE4 astrocytes have increased mitochondrial motility, reduction of Parkin, a protein involved in mitophagy, and reduction in mitochondrial DNA content compared to ApoE3 astrocytes. In summary, we demonstrated, for the first time, that endogenous ApoE4 alters calcium signalling and mitochondrial functions in astrocytes. Taking into account that ApoE is expressed throughout the life of individuals, these astrocytic alterations might appear in the early stages of the Alzheimer’s disease. In order to advance in the detection of such early phases of the pathology, and since cerebrospinal fluid proteins reflect the cellular function of brain cells, we next identified a group of astrocytic proteins present in the cerebrospinal fluid related to Alzheimer’s disease that we propose as a functional astrocytic signature for early stages of the disease. This signature is composed of S100B, ApoE, prostaglandin D2 synthetase, cystatin 3, integral membrane protein 2C and clusterin. Overall, endogenous ApoE4 alters astrocyte functions, a phenomenon that can contribute to Alzheimer’s disease, but also, to its detection through cerebrospinal fluid biomarkers.