Caracterització genètica del Limfoma de Cèl·lules del Mantell i la Leucèmia Limfàtica Crònica mitjançant microarrays i tècniques de seqüenciació: noves eines pel diagnòstic i pronòstic

Abstract

La hibridació in situ fluorescent, o FISH, és una tècnica molecular que s'utilitza en la rutina clínica pel diagnòstic i l'estratificació de diferents neoplàsies. En els estudis d'aquesta tesi s'ha observat que en neoplàsies limfoides de cèl·lula B, la tècnica de FISH té algunes limitacions i que són necessàries millores per fer un diagnòstic i una estratificació pronòstica més acurats.

En l'estudi 1 proposem una nova plataforma de microarray per estratificar la Leucèmia limfàtica crònica (CLL) sense la necessitat d'utilitzar la tècnica de FISH. La CLL és una malaltia molt comú amb un curs clínic molt variable. S’ha descrit que diferents alteracions genètiques i la complexitat genòmica estan relacionades amb un pitjor pronòstic. L'objectiu de l'estudi 1 va ser dissenyar una plataforma de microarray, anomenada qChipHemo, que analitzés no només les quatre alteracions recurrents en la CLL, que s’analitzen amb la tècnica de FISH, sinó també altres regions recurrents, la complexitat genòmica i la cromotripsi. Utilitzant qChipHemo vam poder estratificar, en un sol experiment i amb elevada sensibilitat, els casos analitzant totes les alteracions amb significat pronòstic, com 11q, 13q, 17p, la complexitat genòmica o la cromostripsi. Per tant, podem concloure que l'ús de qChipHemo permet una millor estratificació pronòstica en la CLL comparat amb la tècnica de FISH i proposem que seria una bona opció per ser utilitzada en la rutina clínica.

En l'estudi 2 vam poder identificar l'alteració oncogènica primària en la majoria de casos amb Limfoma de cèl·lules del mantell Ciclina D1-negatiu (MCL), un subgrup de MCL que no presenta la translocació oncogènica primària t(11;14)(q13;q32) ni la sobreexpressió de ciclina D1. Mitjançant la tècnica de FISH vam poder detectar que el 70% dels casos MCL Ciclina D1-negatius presentaven una translocació a CCND2 provocant la seva sobreexpressió. La resta dels casos sobreexpressaven CCND2, CCND3 o CCNE1 i CCNE2 concomitant sense reordenament aparent utilitzant la tècnica de FISH break-apart. Mitjançant tècniques de seqüenciació de nova generació (NGS) vam poder detectar una inserció críptica de l'enhancer de la immunoglobulina IGK o IGL que explicava la sobreexpressió de la ciclina D3 en 3 casos. A partir de la localització de la inserció obtinguda per NGS, vam poder dissenyar unes sondes específiques per poder detectar el reordenament críptic utilitzant FISH amb sondes de fusió i vam observar que en un 16% dels casos presentaven una inserció críptica de l'enhancer de les immunoglobulines proper a CCND3 i 7% dels casos proper a CCND2. Per tant, utilitzant una combinació de tècniques moleculars i FISH amb sondes específiques hem pogut detectar el reordenament primari oncogènic en el 93% dels casos MCL Ciclina D1-negatius. La detecció d'aquests reordenaments permet, doncs, diagnosticar d'una manera més acurada els casos MCL Ciclina D1-negatius.

Per concloure, creiem que l'ús de FISH en la rutina clínica per al pronòstic i diagnòstic en neoplàsies limfoides de cèl·lula B té unes limitacions. No obstant, l'ús de noves tecnologies i la combinació del FISH amb tècniques moleculars permeten que el pronòstic i el diagnòstic en la CLL i el MCL sigui més acurat.

The main goal of study 1 and study of the thesis is the study of different B cell lymphomas using Next Generation Techniques (NGS) that enable us to better diagnose and stratify patients in an accurate way, that could replace techniques such as FISH.

In the study 1, we propose a new microarray platform that could stratify Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) patients without using FISH technique. CLL is a heterogeneous disease with a variable clinical course. It has been published different genetic alterations and genomic complexity related with worse prognosis. The aim of study 1 is to design a platform, named qChipHemo, that stratify CLL patients using not only the main 4 alterations (11q, 13q, 17 and trisomy 12), but also other frequently genetic alterations, genomic complexity and chromothripsis. In this study we conclude that the use of qChipHemo allows a better prognostic stratification of CLL patients compared to FISH techniques and we suggest using the platform in the clinical routine.

In the study 2, we identified the primary oncogenic alteration in the vast majority of Cyclin D1-negative Mantle Cell Lymphoma (MCL) cases, a MCL subgroup that doesn’t harbour the main reciprocal oncogenic translocation t(11;14)(q13;q32) and neither overexpress cyclin D1. Using FISH techniques, we detected CCND2 translocations in 70% of MCL Cyclin D1-negative cases, overexpressing CCND2. The other cases without any apparent translocation by break-apart FISH, overexpress either CCND2, CCND3 or concomitant CCNE1 and CCNE2. By NGS techniques we detected a cryptic insertion of the immunoglobulin IGK or IGL enhancer near CCND3 in 3 cases. We could design specific probes to detect the cryptic insertion using FISH and we detected 16% and 7% of cases with cryptic insertion near CCND3 and CCND2, respectively. In this study, we conclude that using molecular techniques and FISH together we could detect primary oncogenic rearrangement in 93% of MCL Cyclin D1- negative cases. The rearrangement detection allows to better diagnose these cases.

To conclude, the use of FISH has limitations in clinical routine. The use of new technologies and the combination of FISH and molecular techniques allow an accurate prognostic and diagnostic in CLL and MCL.