Neurodegeneration and inflammation: two crucial pathogenic events in diabetic retinopathy. New experimental insights and clinical perspectives

Abstract

La neurodegeneració és un event precoç en la patogènia de la retinopatia diabètica (RD). De fet, recentment la American Diabetes Association ha definit la RD com una complicació neurovascular teixit-específica, emfatitzant així la importància de la unitat neurovascular en el desenvolupament de la RD. La retina és un teixit que deriva del cervell i disposem d’evidència creixent que indica que els diabètics tipus 2 tenen un major risc de desenvolupar malalties neurodegeneratives com la malaltia d’Alzheimer. Així doncs, sembla raonable postular que els mediadors del procés de neurodegeneració que succeeix al cervell també es troben presents a la retina del pacient diabètic. L’objectiu general d’aquesta tesi doctoral és investigar la relació entre la neurodegeneració a la retina i al cervell i les seves potencials implicacions clíniques i terapèutiques. La primera part d’aquesta tesi doctoral es centra en un seguit d’estudis experimentals per tal d’identificar mediadors de la disfunció de la unitat neurovascular. Amb aquest objectiu, s’ha realitzat un estudi “d’hipòtesi lliure” comparant retines humanes de subjectes no diabètics i diabètics amb i sense activació glial (que és una de les principals característiques de la neurodegeneració). Un dels resultats obtinguts ha estat que diverses vies relacionades amb les malalties neurodegeneratives es troben diferencialment expressades en retines de pacients diabètics i especialment en aquells amb activació glial. Aquesta observació recolza el concepte de que existeix un substrat comú entre els processos neurodegeneratius que succeeixen al cervell i a la retina. A més a més, s’ha observat una disminució en la expressió de diverses proteïnes implicades en el transport axonal i del citoesquelet de l’axó a les retines de donants diabètics amb activació glial. Per altra banda, l’activació glial induïda per la diabetis s’associa a una disregulació del sistema del complement, així com a un increment de les proteïnes que governen el citoesquelet de l’endoteli. Aquests resultats s’han validat per mètodes ortogonals. Aquestes troballes contribueixen no només en la comprensió dels mecanismes implicats en l’increment de la permeabilitat vascular induït per la disfunció de la unitat neurovascular, sinó que podrien tenir potencials implicacions terapèutiques. La segona part d’aquesta tesi doctoral, es basa en una “hipòtesi dirigida” i té l’objectiu d’examinar el paper de l’endotelina-1 en la disfunció neurovascular que succeeix en la RD. Això es fonamenta en el fet de que per mitjà dels receptors ETA l’endotelina-1 indueix dany vascular, mentre que a través dels receptors ETB indueix neurodegeneració. En primer lloc, hem detectat un augment en l’expressió de l’endotelina-1 i els seus receptors (tant ETA i ETB) en les retines de donants diabètics en comparació amb donants no diabètics. En segon lloc, hem pogut demostrar que l’aplicació tòpica de bosentan (que bloqueja els receptors ETA i ETB) prevé la neurodegeneració de la retina induïda per la diabetis en el ratolí db/db. A més, entre els efectes del bosentan hi ha la inhibició de l’activació de les vies induïdes per la diabetis PKC-β, TNF-α i VEGF, fet que explica els beneficis a nivell vascular que ofereix aquest tractament. L’efecte beneficiós dual (neurotròpic i vasculotròpic), així com els resultats de l’estudi farmacocinètic, indiquen que el bosentan pot ésser un excel·lent candidat a explorar en futurs assajos clínics. La tercera part de la tesi és un estudi clínic adreçat a reforçar el concepte de que l’avaluació de la neurodegeneració de la retina podria ser una eina útil per identificar aquells pacients diabètics en risc de desenvolupar demència. En aquest sentit, en un estudi previ vam demostrar que la sensibilitat de la retina avaluada per microperimetria es relacionava amb la neurodegeneració a nivell cerebral i podria ésser un biomarcador útil per identificar aquells pacients diabètics tipus 2 en risc de desenvolupar malaltia d’Alzheimer. En aquest treball hem avaluat si l’estudi de la fixació de la mirada, que és un paràmetre que també pot ser avaluat per microperimetria, s’associa al deteriorament cognitiu. En aquest sentit, estudis previs indiquen que la capacitat per mantenir la mirada fixada en una localització es troba alterada en la malaltia d’Alzheimer. Els nostres resultats mostren que la fixació de la mirada és més inestable a mesura que avança l’estat de deteriorament cognitiu. A més a més, l’avaluació dels paràmetres relacionats amb la fixació millora de forma significativa la sensibilitat de la retina com a test diagnòstic per a diferenciar els pacients diabètics amb deteriorament cognitiu incipient dels normocognitius. Així doncs, la mesura de la sensibilitat de la retina en combinació amb els paràmetres relacionats amb la fixació utilitzant la microperimetria podria ser un mètode fiable per a detectar estadis prodròmics de la demència en la població de diabètics tipus 2. Esperem que aquestes troballes esdevinguin la prova de concepte per a la realització d’un estudi clínic de llarga escala. Aquest treball, contribueix al coneixement dels mediadors de la disfunció neurovascular en etapes inicials de la RD i amplia el coneixement del vincle existent entre la neurodegeneració que succeeix al cervell i a la retina en la població afecta de diabetis mellitus tipus 2. A més a més, les nostres troballes suggereixen futurs candidats com a potencials dianes terapèutiques per al tractament de la RD.

Neurodegeneration is an early event in the pathogenesis of diabetic retinopathy (DR). In fact, the American Diabetes Association has recently defined DR as a highly tissue-specific neurovascular complication, thus emphasizing the importance of the neurovascular unit in the development of DR. The retina is a brain-derived tissue and there is growing evidence indicating that type 2 diabetic subjects are more prone to develop neurodegenerative processes such as Alzheimer’s disease. Therefore, it seems reasonable to postulate that the mediators of the neurodegenerative process that occurs in the brain could also be present in the diabetic retina. On this basis, the general objective of this thesis is to investigate the relationship between retinal and brain neurodegeneration and its potential clinical and therapeutic implications. The first part of this thesis focuses on experimental studies addressed to identifying mediators of impairment of the neurovascular unit. For this purpose a proteomic “hypothesis-free” study was performed comparing human retinas from non-diabetic and diabetic donors with and without glial activation (one of the hallmarks of retinal neurodegeneration). The Ingenuity Pathway Analysis revealed that several critical pathways related to brain neurodegenerative diseases were differently expressed in retinas from diabetic patients and in particular in those with glial activation. This observation supports the concept that a common soil exists in the neurodegenerative processes that occur in the retina and the brain. In addition, a downregulation of several proteins involved in axonal transport and the cytoskeleton was found in retinas from diabetic donors with glial activation. Furthermore, diabetes-induced glial activation was associated with a dysregulation of the complement system, as well as an upregulation of the proteins that govern the cytoskeleton changes. These results were confirmed by orthogonal methods. These novel findings contribute not only to our understanding of the mechanisms involved in the vascular leakage induced by neurovascular unit impairment, but could also have potential therapeutic implications. The second part of this doctoral thesis is based on a “driven hypothesis” aimed at examining whether endothelin-1 plays a pivotal role in the neurovascular unit impairment that occurs in DR. This is based on the fact that by means of ETA receptors ET-1 leads to vascular damage and through ETB induces neurodegeneration. We first found an overexpression of both ET-1 and its receptors (ETA and ETB) in the retinas from diabetic donors in comparison with nondiabetic donors. Second, we found that topical administration of bosentan (a blocker of ETA and ETB receptors) prevented retinal neurodegeneration induced by diabetes in the db/db mouse model. In addition, the inhibition of diabetes-induced upregulation of PKC-β, TNF-α and VEGF plays an important role in the beneficial vascular action of bosentan. These dual beneficial effects of bosentan (neurotrophic and vasculotropic) and the pharmacokinetic results point to this drug as an excellent candidate to be tested in clinical trials. The third part of the thesis is a clinical study addressed to reinforcing the concept that the assessment of retinal neurodegeneration could be a useful tool to identify those diabetic subjects at risk of developing dementia. Indeed, in a previous study we demonstrated that retinal sensitivity assessed by fundus-driven microperimetry was related to brain neurodegeneration and could be a useful biomarker for identifying patients with T2D who are at risk of developing Alzheimer’s disease. In the present work, we assessed whether gaze fixation, a parameter that can also be assessed by retinal microperimetry, is associated with cognitive impairment. This is based on previous evidence indicating that the capacity to maintain visual gaze on a single location (fixation) is hampered in Alzheimer’s disease. Our results showed that gaze fixation is more unstable as cognitive impairment progresses. Moreover the assessment of fixational parameters significantly improves retinal sensitivity assessment in differentiating those subjects with mild cognitive impairment from normocognitive diabetic subjects. Therefore, the measurement of retinal sensitivity in combination with parameters of fixation by using microperimetry could be a reliable method for detecting prodromal stages of dementia in the T2D population. Hopefully, these findings will be the proof of concept of a large scale-clinical study. Overall, this work contributes to the knowledge of the mediators of neurovascular unit impairment in the early stages of DR and increases our understanding of the link between retinal and brain neurodegeneration in the setting of the type 2 diabetic population. In addition, our findings suggest further candidates as new potential targets for the treatment of DR.