Unraveling CK2 inhibition and temozolomide contribution to therapy response in preclinical GL261 glioblastoma: immune system implications and magnetic resonance based nosological imaging

Abstract

El glioblastoma (GB) es el tumor primario más común en adultos. Debido a su mal prognóstico, es urgente encontrar mejoras en su tratamiento. El objetivo de esta tesis es estudiar el efecto de inhibidores de CK2 y del agente alquilante Temozolamida (TMZ) a la respuesta a terapia en el modelo de GB preclínico GL261 utilizando tanto métodos in vitro (línea celular GL261) como in vivo (ratones GL261 con tumores). La enzima CK2 es un tetrámero compuesto por dos subunidades catalíticas (α/ α') y dos subunidades reguladoras (β). En esta tesis, se describe el contenido diferencial de la subunidad CK2 α' en células GL261 con alto y bajo estado de proliferación. Esta diferencia podría afectar potencialmente a la susceptibilidad de estas células al tratamiento con inhibidores de CK2, dependiendo de su estado de proliferación. Además, el efecto del inhibidor dual de CK2 y Pim-1, TDB ha sido evaluado a nivel celular y sistémico utilizando el modelo GL261. Mientras el TDB ejerce efectos muy potentes en células tumorales in vitro, no hemos sido capaces de detectar ningún efecto inhibitorio en CK2 en la masa tumoral de animales GL261 tras la administración del fármaco. Estos resultados apuntan a que sería necesaria la reformulación del fármaco para mejorar su biodisponibilidad y sus efectos. Resultados preliminares de nuestro grupo mostraron una mayor supervivencia en ratones con tumor tratados con una terapia metrónomica inmunogénica (1 dosis cada 6 días) con la combinación de TMZ y el inhibidor de CK2 CX-4945, a pesar de que con otros esquemas de administración no se observara ninguna mejora. En este sentido, se ha descrito que ciertos fármacos inmunogénicos son capaces de desencadenar en células tumorales la exposición y liberación de señales de peligro que provocan la activación de una potente respuesta antitumoral por parte del sistema inmune del huésped. En esta tesis, se han realizado experimentos in vitro para determinar la presencia de señales de peligro en células tratadas con ambos tratamientos, ya sea por separado o en combinación. Los resultados muestran que las células tratadas con TMZ y con la combinación CX-4945+TMZ exponen calreticulina, una señal de daño temprana en la cascada inmunogénica. Además, las células tratadas con CX-4945 y CX-4945+TMZ liberan ATP, otra señal de daño que contribuye a la activación del sistema inmune. Por último, la evolución de ratones con tumores GL261 tratados con TMZ con un esquema de administración inmunogénico ha sido evaluada mediante imágenes nosológicas basadas en la acquisición secuencial en 2 dimensiones de resonancia magnética espectroscópica de imagen (MRSI) para el seguimiento de la respuesta a terapia no invasiva. Nuestro grupo ha descrito biomarcadores basados en imagen capaces de distinguir zonas del tumor respondedoras y no respondedoras, que podrían indicar cambios metabólicos locales, incluyendo la acción del sistema inmune del huésped en el tumor. Los resultados se muestran en forma de imágenes creadas con un código de colores (las llamadas nosológicas) analizadas por machine learning a partir de datos MRSI. El seguimiento de ratones tratados con TMZ mostró que el porcentaje de áreas tumorales identificadas como respondedoras oscilaba con los ciclos de terapia. Este periodo de oscilación (de una duración aproximada de 6 días) coincide con el ciclo inmunogénico descrito en ratones como respuesta al daño producido por TMZ. Esta información puede resultar de ayuda en la predicción de la respuesta y efectividad de una terapia y en el desarrollo de estrategias terapéuticas personalizadas. En conclusión, el uso de terapias no mutagénicas y de ciclos de administración de terapia respetuosos con el sistema inmune, combinado con un seguimiento preciso de la respuesta a terapia mediante estrategias no invasivas, podrían contribuir a la mejora del prognóstico del glioblastoma.

Glioblastoma is the most common primary brain tumor in adults with a very poor prognosis, for which urgent improvements in treatment are needed. The aim of this thesis was to unravel the contribution of the CK2 inhibitors and the alkylating agent Temozolomide (TMZ) to therapy response in the preclinical glioblastoma (GB) murine model GL261 using in vitro (GL261 cell line) and in vivo (GL261 tumor bearing mice) approaches. The enzyme CK2 is a tetramer composed by two catalytic subunits (α/ α') and two regulatory subunits (β). In this Thesis, a differential content of the CK2 α' subunit was observed in highly and slowly proliferating GL261 cells, which could potentially affect the susceptibility of these cells to the treatment with CK2 inhibitors depending on their proliferative status. Moreover, the effect of the dual CK2 and Pim-1 inhibitor TDB was evaluated in the GL261 cell line and in GL261-tumor bearing mice. While TDB showed a potent effect in vitro, we were not able to detect any inhibitory effect on CK2 in the tumor site after administration to tumor-bearing animals, suggesting that changes in the formulation of this drug would be needed to improve bioavailability and performance. Preliminary results from our group showed an increased survival in GL261-tumor bearing mice when treated in a immune-enhanced metronomic schedule (1 dose every 6 days) with the combination of TMZ and the CK2 inhibitor CX-4945, although other administration schedules did not result in such improvement. In this sense, it has been described that tumor cells treated with certain immunogenic drugs expose and release certain molecules called danger signals, leading to the activation of a potent antitumoral host immune response. We have performed in vitro studies in order to assess danger signals after both treatments alone or in combination. Results showed that TMZ and TMZ+CX-4945 GL261 treated cells expose calreticulin, an early danger signal of the immune cycle cascade. Also, CX-4945 and CX-4945+TMZ has been shown to release ATP, another danger signal that binds to P2 receptors, also contributing to the activation of the immune system. Moreover, the evolution of GL261-tumor bearing mice treated with TMZ in an immune enhanced metronomic schedule was evaluated using multislice magnetic resonance spectroscopic image (MRSI) based nosological images for noninvasive therapy response follow-up. Our group has described imaging-based biomarkers that are able to distinguish responding and non-responding tumor zones, probably sampling local changes which include host immune system action over the tumor. Results are shown as a color-coded image (the aforementioned nosological image) resulting from machine learning analysis of MRSI data. The follow-up of TMZ treated mice showed an oscillatory behavior in the percentage of tumor area identified as “responding” within the tumor mass during the transient response to therapy. This oscillation period (ca. 6 days) is in agreement with the immune system cycle in mice in response to damage produced after TMZ administration. This information would be helpful in the future for prediction of therapy response/effectiveness and in the development of personalized therapeutic strategies. In conclusion, the use of non-mutagenic therapies and immune system respectful cycles for therapy administration combined with an accurate therapy response follow-up using non-invasive strategies could help to improve the poor outcome of glioblastoma.