Identification and characterization of candidate genes for peach fruit shape

Abstract

El fruit del préssec deriva de l'ovari madur, que es converteix en drupa. La seva forma pot variar entre rodona i plana, adquirint algunes formes intermèdies com la forma aplanada. En el préssec, el fruit pla (anomenat paraguaià) és causat per un al·lel parcialment dominant que ha d'estar en heterocigosis (Ss), mentre que els fruits d'arbres homozigots (SS) avorten poques setmanes després del quallat del fruit. Investigacions anteriors han identificat un marcador SSR (UDP98-412) altament associat al caràcter i que és adequat per a la seva utilització en selecció assistida per marcadors (SAM). Posteriorment, una anàlisi d'associació va revelar la possible implicació d'una quinasa del tipus Leucine Reach Repeat Receptore Like Kinase (LRR-RLK) en la determinació de la forma del fruit. En concret, una deleció de ~ 10Kb que afecta el promotor i part de la regió codificant d'aquest gen co-segrega amb la forma plana. Aquí, el nostre objectiu era clonar i estudiar en detall aquest gen (Prupe.6G281100) per dilucidar la seva funció en la determinació de la forma del fruit. Aquest gen és ortòleg al gen BAK1 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1). Una anàlisi d'alineament (BLAST) entre proteïnes va identificar homologia significativa amb gens involucrats en diferents processos biològics. El millor alineament es va produir amb el gen AtRLP12, que pot complementar funcionalment CLAVATA2, un regulador clau que controla la mida de la població de cèl·lules del meristema. L'anàlisi per RT-PCR va revelar l'absència de transcripció de l'al·lel parcialment delecionat, associat amb el fenotip pla. Les dades donen suport a Prupe.6G281100 com un gen candidat per a la forma plana en préssec. El genotipat posterior d'un panell més gran de varietats ha identificat tres varietats que escapen a l'associació entre el genotip a Prupe.6G281100 i el fenotip. Les seqüències genòmiques completes d'aquestes tres varietats van revelar variabilitat addicional en altres dos de gens LRR-RLK situats en clúster, juntament amb Prupe.6G281100, al locus S. Gran fracció d'aquesta variabilitat estava acumulada en un d'aquests dos gens (Prupe.6G281500 localitzat a 21.3 Kb de Prupe.6G281100). Aquesta variabilitat, en fase amb la deleció de 10 kb, es va observar en totes les varietats planes. El segon gen amb variabilitat addicional va ser Prupe.6G281400 (a 15.3 Kb de Prupe.6G281100) amb una seqüència de 6.1 Kb eliminada en fase amb l'al·lel S i única per a les varietats amb fenotip discordant. D'acord amb la predicció funcional, els dos gens LRR-RLK tenen la millor homologia amb NUMERO D'ORGANO FLORAL1 (FON1) i amb DWARF1 DE GROSSA TASCA (TD1). A la bibliografia es descriu que aquests gens estan involucrats en el desenvolupament dels meristemes florals i el creixement dels òrgans durant la inflorescència i el desenvolupament de les flors, inclosa l'organització estructural, l'alteració de la forma i la regulació de la mida en diverses espècies. A partir de les nostres dades, formulem aquí una hipòtesi de model de tres al·lels basada en la conformació d'al·lels en els tres gens, que poden estar involucrats, amb diferents nivells de dominància, en la determinació de la forma del fruit. En aquesta tesi també hem analitzat un mutant somàtic amb fruit rodó "UFO-4Mut" derivat de la varietat plana "UFO-4". Les dades genotípics van revelar que aquesta mutació es va produir en cèl·lules de la capa meristemàtica LII. Iniciem l'estudi d'aquests dos cultivars amb l'objectiu principal de validar el paper de Prupe.6G28000 en la determinació de la forma del fruit. No obstant això, la resecuenciación dels dos genomes va revelar una gran regió (6.5Mb) amb pèrdua d'heterozigositat (LOH) en la mostra mutant. La nostra hipòtesi és que la LOH pot haver estat produïda per la reparació d'un trencament de doble cadena (DSB) ocorreguda en el cromosoma que porta l'al·lel que causa el fenotip pla, amb el cromosoma homòleg (que porta l'al·lel per al fruit rodó). Per tant, l'al·lel que produeix una forma plana s'ha eliminat en el mutant i reemplaçat pel que produeix la forma rodona, el que explica completament la reversió del fenotip. En aquesta tesi també vam iniciar el desenvolupament dels protocols per a dues tècniques diferents. Una d'elles té com a objectiu la visualització de reordenaments cromosòmics en cèl·lules somàtiques per FISH. L'altre consisteix en l'ús de vectors virals per induir l'expressió de gens en préssec. Hem establert els primers passos en l'establiment d'aquests protocols, els quals es discuteixen en aquest manuscrit de tesi.

El fruto del melocotón deriva del ovario maduro, que se convierte en drupa. Su forma puede variar entre redonda y plana, adquiriendo algunas formas intermedias como la forma achatada. En el melocotón, el fruto plano (llamado paraguayo) es causado por un alelo parcialmente dominante que debe estar en heterocigosis (Ss), mientras que los frutos de árboles homocigotos (SS) abortan pocas semanas después del cuajado del fruto. Investigaciones anteriores han identificado un marcador SSR (UDP98-412) altamente asociado al carácter y que es adecuado para su utilización en selección asistida por marcadores (SAM). Posteriormente, un análisis de asociación reveló la posible implicación de una quinasa del tipo Leucine Reach Repeat Receptore Like Kinase (LRR-RLK) en la determinación de la forma del fruto. En concreto, una deleción de ~ 10Kb que afecta al promotor y parte de la región codificante de ese gen co-segrega con la forma plana. Aquí, nuestro objetivo era clonar y estudiar en detalle ese gen (Prupe.6G281100) para dilucidar su función en la determinación de la forma del fruto. Este gen es ortólogo al gen BAK1 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1). Un análisis de alineamiento (BLAST) entre proteínas identificó homología significativa con genes involucrados en diferentes procesos biológicos. El mejor alineamiento se produjo con el gen AtRLP12, que puede complementar funcionalmente CLAVATA2, un regulador clave que controla el tamaño de la población de células del meristemo. El análisis por RT-PCR reveló la ausencia de transcripción del alelo parcialmente delecionado, asociado con el fenotipo plano. Los datos respaldan a Prupe.6G281100 como un gen candidato para la forma plana en melocotón. El genotipo posterior de un panel mayor de variedades ha identificado tres variedades que escapan a la asociación entre el genotipo en Prupe.6G281100 y el fenotipo. Las secuencias genómicas completas de estas tres variedades revelaron variabilidad adicional en otros dos de genes LRR-RLK situados en cluster, junto con Prupe.6G281100, en el locus S. Gran fracción de esta variabilidad estaba acumulada en uno de estos dos genes (Prupe.6G281500 localizado a 21.3 Kb de Prupe.6G281100). Esta variabilidad, en fase con la deleción de 10 kb, se observó en todas las variedades planas. El segundo gen con variabilidad adicional fue Prupe.6G281400 (a 15.3 Kb de Prupe.6G28110) con una secuencia de 6.1 Kb eliminada en fase con el alelo S y única para las variedades con fenotipo discordante. De acuerdo con la predicción funcional, los dos genes LRR-RLK tienen la mejor homología con NUMERO DE ORGANO FLORAL1 (FON1) y con DWARF1 DE GRUESA TASCA (TD1). En la bibliografía se describe que estos genes están involucrados en el desarrollo de los meristemos florales y el crecimiento de los órganos durante la inflorescencia y el desarrollo de las flores, incluida la organización estructural, la alteración de la forma y la regulación del tamaño en diversas especies. A partir de nuestros datos, formulamos aquí una hipótesis de modelo de tres alelos basada en la conformación de alelos en los tres genes, que pueden estar involucrados, con diferentes niveles de dominancia, en la determinación de la forma del fruto. En esta tesis también hemos analizado un mutante somático con fruto redondo "UFO-4Mut" derivado de la variedad plana "UFO-4". Los datos genotípicos revelaron que esta mutación se produjo en células de la capa meristemática LII. Iniciamos el estudio de estos dos cultivares con el objetivo principal de validar el papel de Prupe.6G28000 en la determinación de la forma del fruto. Sin embargo, la resecuenciación de los dos genomas reveló una gran región (6.5Mb) con pérdida de heterocigosidad (LOH) en la muestra mutante. Nuestra hipótesis es que la LOH puede haber sido producida por la reparación de una rotura de doble cadena (DSB) ocurrida en el cromosoma que porta el alelo que causa el fenotipo plano, con el cromosoma homólogo (que lleva el alelo para el fruto redondo). Por lo tanto, el alelo que produce una forma plana se ha eliminado en el mutante y reemplazado por el que produce la forma redonda, lo que explica completamente la reversión del fenotipo. En esta tesis también iniciamos la puesta a punto de protocolos para dos técnicas diferentes. Una de ellas tiene como objetivo la visualización de reordenamientos del genoma en cromosomas de células somáticas por FISH. El otro consiste en el uso de vectores virales para inducir la expresión de genes en melocotón. Hemos establecido los primeros pasos de estos protocolos se han establecido, los cuales se discuten en este manuscrito de tesis.

Peach fruit derives from the ripen ovary, developing into drupes whose shape may vary from round to flat, acquiring some intermediates shapes as the oblate. In peach, the flat phenotype is caused by a partially dominant allele in heterozygosis (Ss), fruit from homozygous trees (SS) abort a few weeks after fruit setting. Previous research has identified a SSR marker (UDP98-412) highly associated with the trait, found suitable for marker assisted selection (MAS). Later, an association analysis suggested the putative involvement of a leucine rich receptor-like kinase (LRR-RLK) in fruit shape determination. Specifically, a ~10Kb deletion affecting the promoter and part of the coding region of the gene co-segregated with the flat shape. Here our goal was to clone and study in detail that gene (Prupe.6G281100) to elucidate its function in determining the shape of the fruit. This gene is orthologous to the BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1 (BAK1). Protein BLAST alignment identified significant hits with genes involved in different biological processes. Best protein hit occurred with AtRLP12, which may functionally complement CLAVATA2, a key regulator that controls the stem cell population size. RT-PCR analysis revealed the absence of transcription of the partially deleted allele associated with the flat phenotype. The data support Prupe.6G281100 as a candidate gene for flat shape in peach. The posterior screening of larger sample panel has identified three varieties escaping the association between genotype at Prupe.6G281100 and the phenotype. The whole genome sequences of these three varieties revealed additional variability in other two LRR-RLKs genes clustering, together with Prupe.6G281100, in the S locus. Large fraction of this variability accumulated in one of these two genes (Prupe.6G281500 located 21.3 Kb downstream Prupe.6G281100). This variability, in phase with the 10 Kb deletion, was observed in all flat varieties. The second gene with additional variability was Prupe.6G281400 (15.3 Kb downstream Prupe.6G28110) with a 6.1 Kb sequences deleted in phase with the S allele and unique to the outlier varieties. According to gene function prediction, the two LRR-RLKs genes have best homology with FLORAL ORGAN NUMBER1 (FON1) and THICK TASSEL DWARF1 (TD1). These genes have been reported to be involved in mediating floral meristems and organs growth during inflorescence and flower development, including structural organization, shape alteration and size regulation in various species. We formulate here a three allele model hypothesis based on allele conformation at the three genes, which may be involved at different levels of dominance, in fruit shape determination. In this thesis we have also analyzed a somatic mutant with round fruit ‘UFO-4Mut’ derived from the flat variety ‘UFO-4’. Genotypic data revealed that this mutation occurred in cells of the meristematic layer LII. We initiated the study of these two cultivars with the main objective of validating Prupe.6G28000 role in fruit shape determination. However, whole genome analysis revealed a large region (6.5 Mb) in the mutant sample with loss of heterozygosity (LOH). We hypothesize that the LOH may have been produced by the repair of a double strand break (DSB) in the chromosome carrying the allele causing the flat phenotype with the homologous chromosome (carrying the allele for the round). Therefore, the allele producing flat shape has been deleted in the mutant and replaced by the one producing the round shape, which fully explains the phenotype reversion. In this thesis we also initiated protocols for two different techniques. One of them aims at the visualization of genome rearrangements in peach somatic cells by FISH. The other consists on the use of virus vectors to induce gene expression in peach. First steps in the setting of these protocols have been established and are discussed in this thesis manuscript.