The role of GCP8 in microtubule nucleation and cell cicle progression

Abstract

Microtubules (MTs) mediate a range of essential cellular processes including cell division, intracellular transport and organelle positioning, by forming specifically adapted arrays. Assembly, maintenance and remodelling of these arrays crucially depend on the de novo formation of MTs, termed nucleation, and its regulation in space and time. This process is mediated by the γ-­‐tubulin ring complex (γTuRC), and impairment of the function of this complex is typically associated with mitotic defects. However, while the depletion of most γTuRC subunits compromises mitotic progression, the main role of GCP8/MZT2 seems to be the regulation of MT nucleation at the centrosome during interphase, although the molecular details are still unclear.

Therefore, the main goal of this project was to elucidate the mechanism by which GCP8 regulates interphase MT organization.

I found that GCP8 regulates MT nucleation by direct binding to a small segment at the N-­‐terminal end of the GCP2 subunit of the TuRC. Interestingly, using immunoprecipitation coupled to mass spectrometry, I have identified the MT depolymerase KIF2A as an interactor of GCP8. GCP8 recruits KIF2A to inhibit γTuRC-­‐ dependent nucleation at the centrosome and the Golgi apparatus. Moreover, I have observed that the depletion of GCP8 or KIF2A also results in loss of Golgi integrity. Compared to control cells, where the Golgi is typically organized as a ribbon on one side of the centrosome, Golgi membranes in knockdown cells appear more condensed and cluster tightly around the centrosome. Curiously, these defects promote cell cycle exit in non-­‐transformed RPE-­‐1 cells. Cell cycle exit is p53-­‐ independent and thus is unlikely to be caused by problems during mitotic progression. Strikingly, depletion of GCP8 or KIF2A impairs mTOR activation which may explain the cell cycle progression defect.

In summary, by analysing the contribution of GCP8 in the regulation of interphase MT nucleation, I have described an unexpected mechanism that links MT-­‐dependent organization of the centrosome-­‐Golgi axis to G1/S progression and involves regulation of mTOR.

Los microtúbulos (MTs) regulan una amplia variedad de procesos celulares, incluyendo la división celular, el transporte intracelular y la posición de los orgánulos, al formar una red específicamente adaptada. El ensamblaje, mantenimiento y remodelación de estas redes depende crucialmente de la formación de nuevos MTs, denominada nucleación, y de su regulación en el espacio y tiempo. Este proceso está mediado por el por el complejo en anillo de γ-­‐tubulina (γTuRC) y defectos en la función de este complejo están directamente asociados con problemas mitóticos.

Sin embargo, pese a que la depleción de la mayoría de las subunidades del γTuRC compromete la progresión de la mitosis, la función principal de GCP8/MZT2 parece ser la nucleación de MTs desde los centrosomas durante la interfase, aunque se desconocen los mecanismos moleculares.

GCP8 regula la nucleación de MTs mediante la unión a través del externo N-­‐terminal de la subunidad GCP2. Mediante técnicas de inmunoprecipitación acoplada a espectrometría de masas, identifiqué la proteína KIF2A, una despolimerizadora de MTs, como un interactor de GCP8. KIF2A es reclutada por GCP8 para inhibir la nucleación dependiente del γTuRC en los centrosomas y en el aparato de Golgi. Además, observé que la depleción tanto de GCP8 como de KIF2A da lugar a la pérdida de la integridad del Golgi. Comparado células control, donde el Golgi está típicamente organizado como un lazo o “ribbon” próximo al centrosoma, las membranas del Golgi en ausencia de GCP8 o KIF2A están más condensadas y estrechamente agrupadas alrededor del centrosoma. Curiosamente, estos defectos dan lugar a la salida del ciclo celular en células RPE-­‐1. Esta salida es independiente de la vía de señalización p53 por lo que es improbable que estos defectos se deban a problemas durante la progresión de la mitosis. Sorprendentemente, la depleción de GCP8 o KIF2A impide la activación de la mTOR lo que podría explicar los defectos en la progresión del ciclo celular.

En resumen, al analizar la contribución de GCP8 en la regulación de la nucleación de MTs durante la interfase he conseguido describir un inesperado mecanismo que vincula la organización de MT dependiente del eje centrosoma-­‐Golgi con la progresión de las fases G1/S del ciclo celular, involucrando a la vía de señalización de mTOR.