The Ppz protein phosphatase as a potential novel antifungal target

Abstract

Las infecciones fúngicas invasivas son una amenaza enorme, pero actualmente solo hay un limitado número de medicamentos antifúngicos disponibles. El aumento de la incidencia de infecciones fúngicas ha agravado la necesidad de nuevos enfoques para las terapias antifúngicas. Nuestro laboratorio descubrió en S. cerevisiae la proteína fosfatasa (PPasa) Ppz1, que participa en múltiples procesos celulares y es importante en la regulación de la homeostasis de los cationes monovalentes. En la levadura, Ppz1 está inhibida por dos proteínas reguladoras, Hal3 y Vhs3. Estas dos proteínas tienen propiedades moonlighting, ya que contribuyen a la formación de una PPC descarboxilasa heterotrimérica atípica, crucial para la biosíntesis de CoA. Ppz1 se encuentra solo en hongos, incluidos los patógenos y se ha identificado como un determinante de virulencia en Candida albicans y Aspergillus fumigatus. Además, cuando se sobreexpresa, parece ser la proteína más tóxica en las levaduras. Estas características definen a Ppz1 como un posible objetivo para el desarrollo de terapias antifúngicas. El primer objetivo de este proyecto es contribuir a dilucidar las bases moleculares de la toxicidad de Ppz1. Primero, mediante el uso de una cepa de sobreexpresión condicional de Ppz1 (ZCZ01, donde reemplazamos el promotor PPZ1 por el promotor GAL1-10), hemos confirmado que el efecto tóxico de Ppz1 se produce debido al aumento en su actividad fosfatasa y no al agotamiento de Hal3/Vhs3. Además, el defecto de crecimiento causado por la sobreexpresión de Ppz1 se caracterizó por crecimiento en líquido y en sólido, y por citometría de flujo. Dado que se sabe que Ppz1 inhibe la entrada de potasio al regular los transportadores de alta afinidad Trk1/Trk2, también hemos confirmado que un exceso de potasio no rescata la letalidad condicional causada por la sobreexpresión de Ppz1. Además, hemos definido los cambios transcriptómicos causados por la sobreexpresión de Ppz1 bajo el promotor GAL1-10, que han revelado la aparición de una respuesta a estrés oxidativo. Cryptococcus neoformans es un hongo patógeno que produce meningoencefalitis en pacientes inmunodeprimidos (principalmente HIV+) y es responsable de una alta tasa de mortalidad en infecciones invasivas. Aquí presentamos la caracterización funcional de CnPpz1 y dos posibles proteínas similares a Hal3: CnHal3a y CnHal3b. CnPpz1 es una PPasa funcional y parcialmente reemplaza la ScPpz1 endógena. Tanto CnHal3a como CnHal3b interactúan con ScPpz1 y CnPpz1 in vitro, pero no inhiben su actividad fosfatasa. Consistentemente, cuando se expresan en S. cerevisiae, reproducen pobremente las propiedades reguladoras de Ppz1 típicas de ScHal3. Por el contrario, ambas proteínas son PPCDC monogénicas funcionales. Ustilago maydis representa un importante organismo modelos eucariota de patógenos de plantas y se ha considerado como uno de los diez principales patógenos fúngicos de plantas. En este estudio mostramos la caracterización funcional de UmPpz1 y UmHal3. Hemos descubierto que UmPpz1 es una PPasa funcional y parcialmente imita a ScPpz1 in vivo. Tanto UmHal3 como su dominio PPCDC interactúan con ScPpz1 y UmPpz1 in vitro, mientras que no se observa la capacidad de inhibir la actividad de la fosfatasa. En S. cerevisiae, si bien UmHal3 no es capaz de inhibir la ScPpz1, se demuestra como una PPCDC funcional. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo permitenestablecer las bases de la toxicidad de Ppz1 en S. cerevisiae y proporcionan los fundamentos para comprender la regulación y el papel funcional del sistema Ppz1-Hal3 en el hongo patógeno humano C. neoformans y el hongo patógeno de plantas U. maydis.

Invasive fungal infections are an enormous threat, while only a limited number of antifungal drugs are currently available. The increasing incidence of fungal infections has aggravated the need for novel approaches for antifungal therapies. Our laboratory has discovered in S. cerevisiae the protein phosphatase (PPase) Ppz1, which is involved in multiple cellular processes and is important in the regulation of monovalent cation homeostasis. In budding yeast, Ppz1 is inhibited by two regulatory proteins, Hal3 and Vhs3. These two proteins have moonlighting properties, as they contribute to the formation of an atypical heterotrimeric PPC decarboxylase enzyme, crucial for CoA biosynthesis. Ppz1 is found only in fungi, including pathogenic ones, and has been found to be a virulence determinant in Candida albicans and Aspergillus fumigatus. In addition, when overexpressed, it appears to be the most toxic protein in budding yeast. These characteristics define Ppz1 as a possible target for antifungal therapies. This project aims to elucidate the molecular basis of Ppz1 toxicity. First, by using a conditional Ppz1 overexpressing strain (ZCZ01, in which we replaced the PPZ1 promoter by the GAL1-10 promoter), we have confirmed that the toxic effect of Ppz1 occurs due to the increase in its phosphatase activity and not to depletion of Hal3/Vhs3. Besides, the growth defect caused by overexpression of Ppz1 was characterized by liquid growth assay, dot assay and flow cytometry. Since it is known that Ppz1 inhibits entry of potassium by regulating the Trk1/Trk2 high-affinity transporters, we also have confirmed that a potassium surplus does not rescue the conditional lethality caused by overexpression of Ppz1. In addition, we have defined the transcriptomic changes caused by overexpression of Ppz1 from the GAL1-10 promoter, which revealed the development of an oxidative stress response. Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that produces meningoencephalitis in immunosuppressed patients (mainly HIV+) and is responsible for a high rate of mortality in invasive infections. Here we report the functional characterization of CnPpz1 and two possible Hal3-like proteins, CnHal3a and CnHal3b. CnPpz1 is a functional PPase and partially replaced endogenous ScPpz1. Both CnHal3a and CnHal3b interact with ScPpz1 and CnPpz1 in vitro but do not inhibit their phosphatase activity. Consistently, when expressed in S. cerevisiae, they poorly reproduced the Ppz1-regulatory properties of ScHal3. In contrast, both proteins were functional monogenic PPCDCs. Ustilago maydis represents an important eukaryotic plant pathogen model system and has been considered one of the top ten plant fungal pathogens. Here we describe the functional characterization of UmPpz1 and UmHal3. We show that UmPpz1 is a functional PPase that partially mimics ScPpz1 in vivo. Both UmHal3 and its PPCDC domain interact with ScPpz1 and UmPpz1 in vitro, but the capacity to inhibit the phosphatase activity is not observed. In S. cerevisiae UmHal3 is not able to inhibit the ScPpz1 whereas is demonstrated as a functional PPCDC. Overall, the results obtained in this work have established a basis of Ppz1 toxicity in S. cerevisiae and provide the foundations for understanding the regulation and functional role of the Ppz1-Hal3 system in the human pathogenic fungus C. neoformans and the plant pathogenic fungus U. maydis.