Complejidad y conservación de la quasiespecies del virus de la hepatitis B analizada mediante secuenciación masiva en el gen X. Asociación con la actividad replicativa e identificación de regiones híper-conservadas en el genoma viral

Abstract

La proteína X del virus de la hepatitis B (HBx), codificada por el gen X de este virus (HBX), es crucial para la replicación del VHB y regula la expresión de múltiples genes del huésped. Por este motivo deben existir zonas altamente conservadas a nivel nucleotídico (HBX) y/o aminoacídico (HBx), esenciales para su actividad reguladora. Sin embargo, las inserciones y deleciones descritas en el extremo C-terminal de esta proteína, parecen limitar la posibilidad de que estas zonas estén en la región 3’ de HBX, por eso se ha escogido estudiar mediante la tecnología de secuenciación masiva la variabilidad del extremo 5’de HBX. En esta región se han identificado 2 regiones híper-conservadas, que además podrían ser utilizadas como potenciales dianas terapéuticas para una nueva estrategia de tratamiento antiviral basada en la terapia génica contra la HBx mediante el silenciamiento génico. Este tratamiento podría ser útil para conseguir la “cura funcional” de la infección en todos los estadios clínicos y en presencia de todos los genotipos virales. Además de la conservación del extremo 5’ de HBX en esta tesis también se ha estudiado en profundidad la complejidad y variantes específicas de la quasiespecies (QS) de esta región en pacientes en diferentes etapas clínicas de la infección crónica por el VHB HBeAg (-), para investigar su relación con los mecanismos que permiten controlar la replicación viral. El estudio de la complejidad y la variabilidad de la QS de un grupo de pacientes con infección crónica HBeAg (-) (IC) evidenció, en estos pacientes, una QS más conservada y compleja que en los pacientes con hepatitis crónica (en presencia o no de lesiones hepáticas como la cirrosis y el HCC), caracterizada por la presencia de un alto número de haplotipos altamente mutados probablemente a muy bajas frecuencias, por lo que no afectan a la conservación. Asimismo, se ha evidenciado un grupo de mutaciones genotipo-específicas. En concreto se ha descrito un patrón mutacional en los haplotipos de genotipo D de los IC asociado a una probable reducción de la expresión viral. Este patrón mutacional genotipo-específico evidencia la necesidad de genotipar adecuadamente el virus en el seguimiento de los pacientes infectados por VHB. En resumen, el extremo 5’de HBX contiene regiones híper-conservadas que podrían ser esenciales para la función de la HBx y explotadas como diana para el tratamiento antiviral basado en terapia génica. Además la QS de los pacientes IC presenta características diferenciales de complejidad y conservación. Estas características junto con patrones de mutaciones genotipo-específicas, podrían estar relacionados con la baja replicación del VHB en estos pacientes.

The hepatitis B virus X protein (HBx), encoded by the X gene of this virus (HBX), is crucial for HBV replication and regulates the expression of multiple host genes. For this reason, there must be highly conserved areas at nucleotide (HBX) and/or amino acid (HBx) level, essential for its regulatory activity. However, the insertions and deletions described in the C-terminal end of this protein seem to limit the possibility that these areas are located in the 3’ region of HBX. By this reason, the 5’-end of HBX has been chosen to study its conservation by next-generation sequencing. In this region, 2 hyper-conserved regions have been identified. These regions could be used as potential therapeutic targets for a new antiviral treatment strategy, based on gene therapy against HBx through gene silencing. This treatment could be useful to achieve “functional cure” of the HBV infection in all clinical stages and in the presence of all viral genotypes. In addition to the conservation of the 5’ end of HBX, in this thesis the complexity and specific variants of the quasispecies (QS) of this region have also been studied in depth in patients at different clinical stages of HBeAg (-) chronic HBV infection, to investigate its relationship with the mechanisms that allow to control viral replication. The study of the complexity and variability of the QS of a group of patients with HBeAg (-) chronic infection (IC) showed a more conserved and complex QS in these patients than in patients with chronic hepatitis (with or without liver lesion such liver cirrhosis and HCC), characterized by the presence of a high number of highly mutated haplotypes, probably at very low frequencies, so they do not affect conservation. Likewise, a group of genotype-specific mutations has been evidenced. In particular, a mutational pattern has been described in genotype D haplotypes of IC patients, probably associated with a reduction of viral expression. This genotype-specific mutational pattern demonstrates the need to adequately genotype the virus in the HBV infected patients follow-up. In summary, the 5’-end of HBX contains hyper-conserved regions that could be essential for the HBx function and could be exploited as a target for antiviral treatment based on gene therapy. In addition, the IC patients’ QS presents differential characteristics of complexity and conservation. These characteristics, together with patterns of genotype-specific mutations, could be related to the low replication of HBV in these patients.