Enginyeria de glicosintases derivades de quitinases GH18 per a la polimerització de quitooligosacàrids

Author

Alsina Verdú, Cristina

Director

Planas Sauter, Antoni

Date of defense

2019-07-15

Pages

315 p.



Department/Institute

Universitat Ramon Llull. IQS

Abstract

Els quitosans i quitooligosacàrids (COS), obtinguts per enzims modificadors de la quitina, presenten un elevat interès biotecnològic a causa de l’important nombre d’aplicacions en àrees tant diverses com són l’agricultura, el tractament d’aigües, la indústria alimentària, la biomedicina i la cosmètica, entre d’altres. D’entre les funcions biològiques dins la indústria medicofarmacèutica destaquen activitats antiinflamatòries, immunoestimulants, antimicrobianes, antitumorals, de prevenció de l’obesitat i control del colesterol, com a vectors per a teràpia gènica i de promoció de la cicatrització i regeneració de la pell. Aquestes propietats biològiques dels COS no només són dependents del grau de polimerització i acetilació sinó que possiblement també depenen del patró d’acetilació d’aquests. Actualment la síntesi de COS presenta dos problemes principals: poca reproductibilitat entre lots i l’origen animal dels productes, que dificulten la seva utilització en la indústria medicofarmacèutica. Amb l’objectiu de sobreposar-se a aquestes limitacions s’ha pretès desenvolupar una plataforma biotecnològica per a la producció de COS de baix pes molecular amb seqüències definides. El projecte pretén utilitzar l’activitat transglicosidasa de les quitinases com a eina sintètica per a obtenir oligòmers de quitina i quitosà definits amb patrons d’acetilació repetitius. Les quitinases són glicosil hidrolases que catalitzen la hidròlisi d’enllaços glicosídics β1,4 de polímers de quitina i quitosà. Algunes quitinases presenten també activitat de transglicosidació (TG) mitjançant la qual són capaces d’introduir nous enllaços glicosídics entre un molècula donadora i una acceptora amb la conseqüent generació de COS oligomèrics. Aquestes quitinases poden utilitzar-se per a la polimerització in vitro de COS, però l’activitat hidrolítica que presenten tendeix a despolimeritzar els productes de TG ràpidament. Amb l’objectiu d’augmentar l’activitat de TG de quitinases per a la obtenció de nous COS estructuralment definits, en aquesta tesi s’ha aplicat l’estratègia glicosintasa (GS) sobre diferents quitinases de la família GH18 per mutació del residu assistent i l’ús d’un derivat oxazolina com a donador, amb les que s’ha aconseguit una important disminució de l’activitat hidrolítica i un increment de l’activitat de TG. Tot i l’increment de l’activitat de TG, l’activitat hidrolítica residual que presenten dona lloc a la hidròlisi dels productes GS i de TG formats que impedeix augmentar el rendiment. Amb aquest propòsit s’ha optat per la modificació d’un dels enzims seleccionats per enginyeria de proteïnes. Mitjançant mutagènesi dirigida s’ha aconseguit incrementar el rendiment en polímer fins a un 60% (p/p) amb l’ús d’un derivat oxazolina d’un COS de quitina (el 60% del qual correspon al producte de la reacció GS), i també la obtenció d’oligòmers/polímers de quitosà amb l’ús de derivats oxazolina de quitooligosacàrids parcialment desacetilats, estructuralment definits.


Los quitosanos y quitooligosacáridos (COS), obtenidos por enzimas modificadores de la quitina, presentan un elevado interés biotecnológico debido al importante número de aplicaciones en áreas tan dispares como son la agricultura, el tratamiento de aguas, la industria alimenticia, la biomedicina y la cosmética, entre otras. Entre las funciones biológicas dentro de la industria médico-farmacéutica destacan actividades antiinflamatorias, inmunoestimulantes, antimicrobianas, antitumorales, de prevención de la obesidad y control del colesterol, como vectores de terapia génica y de promoción de la cicatrización y regeneración de la piel. Estas propiedades biológicas de los COS no solo son dependientes del grado de polimerización y acetilación sino que posiblemente también dependen del patrón de acetilación de estos. Actualmente la síntesis de COS presenta dos problemas principales: poca reproducibilidad entre lotes y el origen animal de los productos, que dificultan su utilización en la industria médico-farmacéutica. Con el objetivo de sobreponerse a estas limitaciones se ha pretendido desarrollar una plataforma biotecnológica para la producción de COS de bajo peso molecular con secuencias definidas. El proyecto pretende utilizar la actividad transglicosidasa de las quitinasas como herramienta sintética para obtener oligómeros de quitina y quitosano definidos con patrones de acetilación repetitivos. Las quitinasas son glicosil hidrolasas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos β1,4 de polímeros de quitina y quitosano. Algunas quitinasas presentan también actividad de transglicosidación (TG) mediante la cual son capaces de introducir nuevos enlaces glicosídicos entre una molécula donadora y una aceptora con la consecuente generación de COS oligoméricos. Estas quitinasas pueden utilizarse para la polimerización in vitro de COS, pero la actividad de hidrólisis que presentan tiende a despolimerizar los productos de TG rápidamente. Con el objetivo de aumentar la actividad de TG de quitinasas para la obtención de nuevos COS estructuralmente definidos, en esta tesis se ha aplicado la estrategia glicosintasa (GS) sobre diferentes quitinasas de la familia GH18 por mutación del residuo asistente y el uso de un derivado oxazolina como donador, con las que se ha logrado una importante disminución de la actividad de hidrólisis y un incremento de la actividad de TG. A pesar del incremento de la actividad de TG, la actividad hidrolasa residual que presentan da lugar a la hidrólisis de los productos GS y de TG formados que impide el aumento del rendimiento. Con este propósito se ha optado por la modificación de una de las enzimas seleccionadas por ingeniería de proteínas. Mediante mutagénesis dirigida se ha logrado incrementar el rendimiento en polímero hasta un 60% (p/p) con el uso de un derivado oxazolina de un COS de quitina (el 60% del cual corresponde al producto de la reacción GS), y también la obtención de oligómeros/polímeros de quitosano con el uso de derivados oxazolina de quitooligosacáridos parcialmente desacetilados, estructuralmente definidos.


Chitosan and chitooligosaccharides (COS), obtained by chitin-modifying enzymes, are of interest to a wide variety of areas such as agriculture, water treatment, food industry, biomedicine and cosmetics, among others, due to their important number of applications. Among the biological roles on the medical-pharmaceutical industry are amply demonstrated anti-inflammatory, immunostimulants, antimicrobians and antitumorals activities, obesity prevention and cholesterol control, ability of gene and drug delivery, wound healing and skin regeneration activities. These biological properties are not only related to their degree of polymerization and acetylation, but possibly they are also dependent on their pattern of acetylation. Nowadays the synthesis of COS has two main hurdles: a poor reproducibility between batches and the animal origin of the products, which difficult their usage in the medical-pharmaceutical industry. With the goal of overcome these limitations, we were aiming at the development of a biotechnological platform for the production of sequence-defined low molecular weight chitosans. The project addresses the use of the transglicosidase activity of chitinases as a synthetic tool to obtain well-defined oligomers with repeating patterns of acetylation. Chitinases are glycoside hydrolases that catalyse the hydrolysis of β1,4 glycosidic bonds of chitin and chitosan polymers. Some chitinases have also transglycosydase activity (TG), allowing them to introduce new glycosidic bonds between donor and acceptor sugar molecules with the consequent generation of oligomeric COS. Such transglycosylating chitinases can be used for the in vitro polymerization of COS, but the hydrolytic activity of these enzymes tends to depolymerise the TG products quickly. With the main goal of increase TG activity of chitinases to obtain new well-defined COS, in the present work we use the glycosynthase technology (GS) on different GH18 chitinases by mutation of the assisting residue and the use of an activated glycosyl donor (an oxazoline derivative), with which an important diminish of the hydrolytic activity and an increase of the TG activity have been obtained. Despite the higher TG activity, the residual hydrolytic activity of the assisting residue mutants results in the hydrolysis of the GS and TG products that not allow the increase of the polymer yield. Protein engineering (rational approach) was used to modify one of the selected enzymes. By site-directed mutagenesis it has been possible to increase the polymer yield up to 60% (w/w) using a chitin oligomer oxazoline derivative (the 60% of which corresponds to the product of the GS reaction), and it has also been possible to obtain chitosan oligomers/polymers using structurally defined partially deacetylated COS oxazoline derivatives.

Keywords

Glicosintasa; Quitinasa; Oxazolina; Transglicosidació; Quitina; Quitosans; Enginyeria de proteïnes; Biologia molecular

Subjects

577 - Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics

Knowledge Area

Ciències naturals, químiques, físiques i matemàtiques

Documents

Tesi_Cristina_Alzina.pdf

26.03Mb

 

Rights

ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs.

This item appears in the following Collection(s)