Ultraviolet light (UV-C) as a redundant biosafety step for pathogen inactivation in the manufacturing process of spray dried plasma from animal origin

Abstract

El plasma dessecat per atomització (SDP) és una font de proteïnes funcionals obtinguda a partir de sang d’animals sans, aprovats per les autoritats veterinàries per al consum humà. La sang es recull a l'escorxador, es tracta amb anticoagulant, es refreda i es transporta a instal·lacions industrials on es centrifuga per separar els glòbuls vermells de la fracció plasmàtica. Després, el plasma es concentra i s'asseca a altes temperatures (80ºC) per convertir-lo en pols. Aquest mètode conserva l’activitat biològica de les proteïnes. El SDP s’utilitza principalment en dietes de porcí per millorar significativament el guany diari, la ingesta, l’eficiència productiva i per reduir el retard causat per l’aparició de diarrea després del deslletament. Tot i que el SDP es considera un producte segur i el seu procés de fabricació consta diverses etapes de bioseguretat, la seva seguretat sovint es qüestiona donada la seva naturalesa de subproducte hemoderivat, especialment quan apareixen patògens emergents o reemergents. Aquesta tesi doctoral es va centrar en l'avaluació i la validació d'una nova etapa redundant d'inactivació de patògens per a implementar en el procés de producció de SDP, la irradiació UV-C. El treball ha consistit en avaluar l’efectivitat del tractament per irradiació UV-C mitjançant un dispositiu de flux turbulent, SurePure TurbulatorTM, a l’irradiar un plasma natiu inoculat artificialment amb diferents patògens d’interès per a la indústria porcina. Als estudis 1 i 2 es va avaluar l’efecte UV-C sobre la supervivència de Salmonella typhimurium, S. choleraesuis, Enterococcus faecium i Escherichia coli K88 i K99 sotmesos a diferents dosis UV-C. Es van trobar cinètiques d'inactivació no lineal amb un valor de reducció de 4 log10 (4D), proper a 3000 J/L en tots els casos. A l’estudi 3 es va analitzar l’efecte de l’UV-C sobre diferents virus d’interès en la indústria del porcí. La selecció de virus amb envolta va incloure el Virus de la pseudoràbia (PRV), el Virus de la síndrome respiratòria i reproductiva porcina (PRRSV), el Virus de la diarrea epidèmica porcina (PEDV), el Virus de la diarrea viral bovina, el Virus de la grip porcina (SIV) i el Virus de la pesta porcina clàssica (CSFV); i, com a virus sense envolta, el Parvovirus porcí (PPV), Virus de la malaltia vesicular de porc (SVDV), Circovirus porcí 2 (PCV-2) i Senecavirus A (SVA). Tots aquests virus van ser sotmesos a diferents dosis UV-C i, mitjançant la titulació de les mostres, es va construir la seva corba d'inactivació. En termes generals, els resultats van mostrar que els virus amb envolta tenen una sensibilitat superior a l’UV-C, amb valors 4D inferiors a 2000 J/L, que els que no presenten envolta, presentant valors propers a 3000 J/L o més. A l’estudi 4 es va dur a terme un bioassaig utilitzant diferents grups de garrins, inoculats intraperitonealment amb plasma irradiat per UV-C a 0 J/L (plasma no tractat), 3000 i 9000 J/L. Els resultats van mostrar que cap dels porcs dels grups que rebien el plasma irradiat per UV-C es va infectar ni va seroconvertir en front als virus detectats al plasma inicial (PCV-2, PRRSV (soques europees), SIV, PPV, Virus de l’hepatitis E i Rotavirus A), confirmant així l’eficàcia de l’UV-C. Alhora, es varen dissenyar mètodes convencionals de PCR per amplificar amplicons llargs dels genomes de PCV-2 i PEDV. Mitjançant la comparació dels resultats amb els de PCRs quantitatives, es va demostrar que l’UV-C va ser capaç de danyar el genoma viral. Els resultats globals de la present tesi doctoral mostren que l’aparell d’UV-C SurePure TurbulatorTM és eficaç inactivant un ampli ventall de bacteris i virus presents de forma natural en plasma animal líquid recollit d’escorxadors comercials.

El plasma secado por atomización (SDP) es una fuente de proteína funcional obtenida de la sangre de animales sanos, aprobada por las autoridades veterinarias para el consumo humano. La sangre se recoge en el matadero, se trata con anticoagulante, se enfría y se transporta a instalaciones industriales en las que se centrifuga para separar los glóbulos rojos de la fracción plasmática. Luego, el plasma se concentra y se seca por atomización a altas temperaturas (80°C) para convertirlo en polvo. Dicho método conserva la actividad biológica de sus proteínas. El SDP se usa principalmente en dietas porcinas para mejorar significativamente la ganancia diaria, la ingesta, la eficiencia de producción y para reducir el retraso causado por la aparición de diarrea posterior al destete. Aunque el SDP se considera un producto seguro y su proceso de fabricación consta de varias etapas de bioseguridad, su seguridad a menudo se cuestiona debido a su naturaleza de subproducto hemoderivado, especialmente cuando aparecen patógenos emergentes o reemergentes en las poblaciones animales. Esta tesis doctoral se centró en la evaluación y validación de una nueva etapa redundante de inactivación de patógenos a implementar en el proceso de fabricación de SDP, la radiación UV-C. El trabajo ha consistido en evaluar la efectividad del tratamiento de irradiación con UV-C utilizando un dispositivo de flujo turbulento, SurePure TurbulatorTM, al irradiar plasma inoculado artificialmente con diferentes patógenos de interés para la industria porcina. En los estudios 1 y 2, el efecto UV-C sobre la supervivencia bacteriana se evaluó sobre Salmonella typhimurium, S. choleraesuis, Enterococcus faecium y Escherichia coli K88 y K99, sometidas a diferentes dosis de UV-C. Todas las bacterias analizadas mostraron una cinética de inactivación no lineal con un valor de reducción de 4 log10 (4D) cercano a 3000 J/L en todos los casos. En el estudio 3, se analizó el efecto de UV-C en diferentes virus de interés. La selección de virus con envuelta incluyó el Virus de la pseudorabia (PRV), Virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), Virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), Virus de la diarrea viral bovina (BVDV), Virus de la influenza porcina A (SIV) y el virus de la peste porcina clásica (CSFV). El Parvovirus porcino (PPV), Virus de la enfermedad vesicular porcina, Circovirus porcino 2 (PCV-2) y Senecavirus A (SVA) fueron elegidos como virus sin envuelta. Los virus se sometieron a diferentes dosis de UV-C y, mediante la titulación de las muestras, se construyó su curva de inactivación. Los resultados mostraron que los virus envueltos tienen una mayor sensibilidad al l UV-C, con valores 4D inferiores a 2000 J/L, que los no envueltos, con valores 4D alrededor de 3000 J/L o superiores. En el estudio 4 se realizó un bioensayo utilizando diferentes grupos de lechones inoculados por vía intraperitoneal con plasma irradiado por UV-C a 0 (plasma no tratado), 3000 y 9000J/L. Ninguno de los cerdos en los grupos que recibieron el plasma irradiado por UV-C presentó infección o seroconversión frente a los virus cuyo genoma se detectó en el plasma inicial (PCV-2, PRRSV (cepas europeas), SIV, PPV, Virus de la hepatitis E y Rotavirus A), lo que confirma la eficacia de UV-C. Además, se diseñaron PCR convencionales para amplificar amplicones largos de los genomas de PCV-2 y PEDV. Al comparar los resultados con los obtenidos por PCR cuantitativa en tiempo real, se demostró que la UV-C podía dañar el genoma viral. Los resultados generales de la presente tesis doctoral demuestran que el diseño del turbulador SurePure UV-C fue eficaz para inactivar una amplia gama de bacterias y virus presentes de forma natural en el plasma animal líquido comercial.

Spray dried plasma (SDP) is a functional protein source obtained from blood of healthy animals, approved by the veterinary authorities to be fit for slaughter for human consumption. Blood is collected at the slaughterhouse, treated with an anticoagulant, chilled and transported to industrial facilities in which blood is centrifuged to separate the red blood cells from the plasma fraction. Plasma is then concentrated and spray dried at high temperatures (80ºC throughout its substance) to convert it in a powder. Such method preserves the biological activity of its proteins. SDP is mainly used in pig feed diets to significantly improve daily gain, feed intake, production efficiency, and to reduce post-weaning lag caused by the appearance of post-weaning diarrhea. Although SDP is considered a safe product and its manufacturing process consists of several biosafety steps, the security of the SDP is often questioned due to its nature as raw blood by-product, especially when emergent or re-emergent pathogens appear in animal populations. This PhD Thesis focused on the evaluation and validation of a new redundant pathogen inactivation step that may be implemented in the manufacturing process of SDP, the UV-C irradiation. The work has consisted in evaluating the effectiveness of the UV-C irradiation treatment using a turbulent flow device, SurePure TurbulatorTM, when irradiating raw plasma artificially inoculated with different pathogens of interest for the swine industry. In studies 1 and 2 the UV-C effect on bacterial survival was assessed on Salmonella typhimurium, S. choleraesuis, Enterococcus faecium, and Escherichia coli K88 and K99 strains subjected to different UV-C doses. All tested bacteria showed non-linear inactivation kinetics with 4 log10 (4D) reduction value in all cases close to 3000 J/L. In study 3, the effect of UV-C on different viruses of interest in the swine industry was analyzed. The selection of enveloped viruses included Pseudorabies virus, Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), Bovine viral diarrhea virus, Swine inflenza A virus (SIV) and Classical swine fever virus. On the other hand, Porcine parvovirus (PPV), Swine vesicular disease virus, Porcine circovirus 2 (PCV-2) and Senecavirus A (SVA) were chosen as non-enveloped viruses. All these viruses were subjected to different UV-C doses and, by titration of the samples at each UV-C dose, the inactivation curve for each virus was constructed. In general terms, results showed that enveloped viruses have a higher sensitivity to UV-C than non-enveloped ones, being the 4D values less than 2000 J/L for enveloped viruses and around 3000 J/L or higher for non-enveloped ones. To validate the effectiveness of the plasma UV-C irradiation measured in previous studies, a bioassay was carried out in the study 4 using different groups of piglets inoculated intraperitoneally with UV-C irradiated plasma at 0 (untreated plasma), 3000, and 9000J/L. The results showed that none of the pigs in the groups that received the plasma irradiated by UV-C were infected or seroconverted against the viruses which genome was detected in the initial plasma (PCV-2, PRRSV (European strains), SIV, PPV, Hepatitis E virus and Rotavirus A), thus confirming the efficacy of UV-C. Furthermore, in the study 4, conventional PCR methods able to generate long amplicons were designed to amplify fragments of approximately 1.7 kb of PCV-2 and PEDV genomes. By comparison of the results with those of real time quantitative PCRs to detect the same viruses (using short amplicons), it was demonstrated that UV-C was able to damage the viral genome. Overall results of the present PhD Thesis showed that the SurePure UV-C Turbulator design was effective in inactivating a wide range of bacteria and viruses spiked and naturally present in commercially collected liquid animal plasma.