1 La doble vessant del dany per radiació: de les estratègies per a reduir-lo al seu ús en l’estudi de l’Aldosa Reductasa en condicions d’estrès oxidatiu

Abstract

En aquest treball el terme dany per radiació, aplicat a sistemes biològics macromoleculars, fa referència a totes les modificacions, tant estructurals com químiques, induïdes pels raigs X en interaccionar amb la mostra experimental. En aquesta Tesi s’ha estudiat el dany per radiació en diferents sistemes biològics macromoleculars en dues vessants oposades. Per una banda, s’han caracteritzat diversos compostos scavenger nous, que poden ser útils per reduir els efectes del dany per radiació en experiments de cristal·lografia de proteïnes i dispersió de raigs X a angles baixos. Per altra banda, els mateixos efectes provocats pel dany per radicació s’han fet servir per a simular, de manera controlada, condicions d’estrès oxidatiu. Els resultats obtinguts en aquesta Tesi s’han distribuït en quatre capítols diferents. En el Capítol 1 es caracteritza la uridina com a compost scavenger en experiments de cristal·lografia de macromolècules a temperatura ambient. El poder mitigador de la uridina contra el dany per radiació en aquesta tècnica assenyala la potència d’aquest compost en els experiments de dispersió de raigs X a angles baixos publicats per Crosas et al. (2017). En el Capítol 2 s’estenen els resultats obtinguts a més nucleòsids i bases nitrogenades en experiments de dispersió de raigs X a angles baixos: 5-metil uridina, citidina, uridina i citosina. Aquests additius, que són els més potents reportats mai en la literatura, permeten mitigar el dany per radiació de manera molt significativa, millorar la qualitat de les dades i la informació continguda en solucions de proteïnes poc concentrades o amb baixos pesos moleculars, fet que estén el rang d’aplicació de la tècnica de SAXS. El Capítol 3 presenta els estudis de dany per radiació fets en cristalls de lisozim crescuts en presència de l’hidrogel peptídic Fmoc-CF, que es mostra com un compost scavenger efectiu contra el dany per radiació en experiments de cristal·lografia de proteïnes a temperatura ambient. A més, es proposa un nou mètode d’escalat de dades que permet corregir l’error sistemàtic provocat pel dany per radiació global a temperatura ambient. Per últim, en el Capítol 4, es presenten els resultats obtinguts en irradiar l’enzim Aldosa Reductasa, d’interès biomèdic en diabetis. Aquests resultats, publicats a Castellví et al. (2019), permeten aclarir quins són els canvis estructurals de la forma activada de la proteïna respecte de la nativa, i aclareixen perquè molts dels inhibidors farmacològics d’aquest enzim perden potència en tests in vivo.

The term radiation damage in this work is applied to biological macromolecular systems and is defined as the structural and chemical modifications induced by X-rays when interacting with the sample under study. This PhD Thesis approaches the effects of the radiation damage in biological macromolecules in two very different ways. In one side, several new scavenger compounds have been characterized to mitigate the radiation damage effects in macromolecular crystallography and small-angle x-ray scattering, which in turn may enlarge the scientific cases in which these techniques can be used. In the other side, the effects produced by the radiation damage are used to mimic oxidative stress conditions in protein solutions. The results obtained in this Thesis are distributed in four chapters. In chapter 1 nucleoside uridine is characterized as a scavenger compound in macromolecular crystallography experiments at room temperature. The scavenging effect of uridine against radiation damage in this technique is in line with the high scavenging power in small angle x-ray experiments reported by Crosas et al. (2017). In chapter 2 the results are extended to more nucleosides and nitrogenous bases in small angle x-ray experiments. These additives, 5-methyl uridine, cytidine, uridine and cytosine, have the highest scavenging power ever reported, improve significantly the quality of the data and the meaningful information obtained in SAXS experiments, allow extending the technique to low molecular weight protein and to highly diluted protein solutions. Chapter 3 characterizes and assesses the radiation scavenging properties of composite lysozyme crystals grown in the hydropeptidic Fmoc-CF gel in macromolecular crystallography experiments at room temperature. Moreover, we propose a new method to scale the crystallographic data which corrects the systematic error induced by global radiation damage at room temperature. Finally, chapter 4 studies the effect of irradiation on aldose reductase, an enzyme which has a biomedical interest in diabetes. The study, which is published in Castellví et al. (2019), identifies the structural changes of the activated form of the protein with respect to the native form, and clarifies the reason why many drugs targeting the protein had their potency decreased in in vivo tests.