Analysis of the levels of monocyte subsets in patients with heart failure

Abstract

La insuficiencia cardíaca es un síndrome, caracterizado por diferentes signos y síntomas clínicos debidos a una anomalía estructural o funcional del corazón. Es una de las cardiopatías más predominantes en los países desarrollados, tanto desde el punto de vista epidemiológico como de sus manifestaciones clínicas. La insuficiencia cardíaca es un problema médico creciente relacionado con una alta tasa de hospitalización e importante mortalidad y un pronóstico desfavorable con coste socioeconómico muy elevado en todo el mundo. Los monocitos son una población heterogénea de células efectoras con funciones clave en el mantenimiento y la restauración de la integridad del tejido y del sistema inmunológico. Mediante citometria de flujo se pueden separar tres subpoblaciones de monocitos humanos distintos: clásicos (CD14 ++ / CD16–), intermedios (CD14 ++ / CD16 +) y no clásicos (CD14– / CD16 +). Poco se sabe acerca de la importancia, la relación entre los niveles de los monocitos circulantes en sangre periférica y su distribución en la insuficiencia cardíaca, incluso menos se conoce si estos parámetros podrían usarse como marcadores predictores de la progresión de la enfermedad. El objetivo principal del proyecto actual fue evaluar la relación entre los niveles y la distribución de las diferentes subpoblaciones monocitarias y la longitud de sus telómeros en pacientes con insuficiencia cardíaca y los eventos adversos, comomortalidad y hospitalización por insuficiencia cardíaca. La tesis doctoral actual describe tres estudios, respectivamente de 28, 400 y 101 pacientes ambulatorios, tratados consecutivamente en una unidad multidisciplinaria de insuficiencia cardíaca desde diciembre de 2013 hasta mayo de 2015. Todos los procedimientos del estudio se realizaron de acuerdo con todos los estándares éticos y todos los participantes proporcionaron un consentimiento informado por escrito. Se extrajeron muestras de sangre periférica de todos los pacientes para su posterior análisis mediante citometría de flujo. Las muestras se incubaron directamente con anticuerpos monoclonales con fluorocromos contra antígenos de superficie específicos de monocitos, tipo CD86 (o HLA -DR), CD14 y CD 16, y en paralelo (en 101 muestras) se analizaron marcadores genéticos (telómeros) mediante un citómetro de flujo. (BD LSRFortessa) en el Departamento de Citolatría de la IGTP. Se analizó la distribución porcentual de cada subconjunto de monocitos y también se determinó cuantitativamente su recuento de células absoluto (U/mL). Durante nuestro proyecto pudimos establecer un nuevo método de análisis conjunta de subpoblaciones de monocitos y con determinación de la longitud relativa de los telómeros, que resulto rápido, preciso y mucho más barato que otros métodos utilizados previamente. En nuestro estudio, la subpoblación intermedia se asoció de forma independiente en el análisis multivariable con mortalidad por todas las causas y con la variable compuesta (mortalidad por todas las causas o ingreso por insuficiencia cardiaca). La determinación cuantitativa del recuento de células absoluto de cada subpoblación de monocitos expresado en U/mL fue superior desde el punto de vista pronóstico al porcentaje de estas subpoblaciones. Se observó una reducción de aproximadamente el 22% en la longitud de los telómeros durante un año en los monocitos de nuestros pacientes, aunque la longitud relativa y el cambio en la longitud de los telómeros no se asociaron significativamente con los resultados. Por lo tanto, no es probable que el cambio en la longitud de los telómeros sea un biomarcador útil de la progresión de la insuficiencia cardíaca. Los monocitos y las subpoblaciones de monocitos podrían usarse en el futuro no solo como un factor predictor, sino que también podrían tomarse en consideración como parte de una terapia de inmunomodulación para los pacientes con insuficiencia cardíaca.

Heart failure is a disorder characterized by different clinical signs and symptoms due to a structural or functional anomaly of the heart. It is the most predominant heart disease in developed countries, both from epidemiological point of view and clinical implications. Indeed, it is a growing medical problem related to major hospitalization needs and high mortality, with significant economic and population burden worldwide. Established prognostic factors, such as age, sex, aetiology, comorbidities, New York Heart Association functional class, left ventricle ejection fraction, and routine laboratory markers might fail to completely and individually predict disease progression and mortality. A good risk stratification strategy is crucial as risk might be refined using several biological biomarkers of different pathophysiological processes that the former mortality risk factors do not necessarily directly reflect. That is why efficient and reliable new prognostic predictor markers are of upmost importance and relevance for the future management of the disease. Monocytes are a heterogeneous population of effector cells with key roles in the maintenance and restoration of tissue integrity. Three distinct human monocyte subsets can be identified by flow cytometry: classical (CD14++/CD16–), intermediate (CD14++/CD16+) and non-classical (CD14–/CD16+). Little is known about the importance, relationship between the levels of the circulating monocytes and their distribution in heart failure, even less if these parameters could be used as a predictor markers for the progression of the disease. The main objective of the current project was to assess the relationship between the levels and distribution of the different circulating monocyte subsets and the length of its telomeres in outpatients with heart failure with adverse events, namely mortality and heart failure hospitalizations. Three cohorts of respectively 28, 400 and 101 ambulatory patients, consecutively treated at a multidisciplinary heart failure Clinic from December 2013 to May 2015 were included in the studies described in this doctoral thesis, independently of the data of their entry into the heart failure Clinic program. All study procedures were performed in accordance with all ethical standards and all participants provided written informed consent. Peripheral blood samples of all patients were extracted for subsequent analysis by flow cytometry. The samples were incubated directly by means of monoclonal antibodies with fluorocromes against monocyte specific surface antigens, type CD86 (or HLA -DR), CD14 and CD 16 and in parallel (in 100 samples) genetic markers (telomeres) were subsequently analyzed by flow cytometer (BD LSRFortessa) in the Department of Citolatry of the IGTP. The percentage distribution of each monocyte subset was analyzed and their absolute cell count (U/mL) was also determined quantitatively. We were able to establish an innovating, accurate and much less expensive method than established ones for simultaneously measuring the different monocyte subsets and the its relative telomere length. In our study, the intermediate subset was independently associated with all-cause death and the composite end-point of all-cause death or heart failure hospitalization, in multivariable analyses. The quantitative determination of the absolute cell count of each monocyte subset expressed by U/mL was superior from the prognostic point of view than the percentage of these monocyte subsets in outpatients with Heart failure. We observed about 22% reduction in telomere length over 1 year in the monocytes of our patients, being the baseline telomere length and change in telomere length not significantly associated with outcomes. Therefore, the change in telomere length is not likely to be a useful biomarker of heart failure progression. The monocytes and monocyte subsets could be used not only as a predictor factor but also might be taken into consideration as part of an immuno-modulation therapy in the future for the heart failure patients.