Biomarkers detection of global infectious diseases based on magnetic particles

Abstract

Las enfermedades infecciosas suponen una gran amenaza para la salud mundial debido a la rápida diseminación y adaptación de los patógenos. El papel principal del diagnóstico clínico es identificar de forma fehaciente una enfermedad en un paciente. Los dispositivos de diagnóstico rápido permiten detectar enfermedades y monitorearlas de forma confiable en cualquier centro sanitario. Entre estos dispositivos, los biosensores electroquímicos presentan una alta sensibilidad y especificidad así como una instrumentación sencilla, pudiendo expandirse fácilmente a plataformas de detección múltiple. Además, la integración de partículas magnéticas (MPs) en métodos de diagnóstico rápido incrementa la sensibilidad y especificidad debido su capacidad para aislar y preconcentrar una molécula diana cuando éstas son modificadas con elementos de bioreconocimiento específico. Así, las MPs modificadas pueden unirse específicamente a biomarcadores y concentrarlos de muestras complejas bajo la actuación magnética, eliminando posibles interferencias. En esta tesis se presenta el desarrollo de estrategias de diagnóstico basados en tecnologías emergentes, asequibles y que requieren un entrenamiento mínimo de los usuarios finales, tales como los biosensores electroquímicos con accionamiento magnético. Primero, se presentan dos tipos de pruebas diagnósticas para la cuantificación de linfocitos CD4 en sangre entera, usando MPs, para el seguimiento rápido de pacientes con HIV en entornos de bajos recursos. Se describen dos formatos, uno en formato tipo ELISA con detección óptica y otro usando electrodos de grafito-epoxi con biosensado electroquímico. En ambos casos la estrategia involucra a) el aislamiento de células CD4 usando MPs-antiCD3 y su marcación utilizando anticuerpos antiCD4 biotinilados; b) la marcación enzimática con estreptavidina-peroxidasa; y c) la detección basada en la actividad enzimática. Esta doble marcación (a través de los receptores CD3 yCD4) no sólo evita interferencias de otras células que expresan alguno de estos receptores, sino que aumenta la especificidad del ensayo. Segundo, se describe un ensayo de liberación de interferon-basado en la detección electroquímica de dicho trascripto producido por linfocitos T previamente aislados de sangre. Este test utiliza MPs para el aislamiento y preconcentración de tres dianas diferentes (linfocitos T, mRNA y ADN doblemente marcado) en el mismo ensayo. Primero, los linfocitos T se aislan usando MPs-antiCD3. En segundo lugar, el mRNA de los linfocitos se preconcentra sobre MPs modificadas con polidT mediante unión a la cola de poli(A). Posteriormente se retrotranscribe el mRNA y se amplifica el cDNA mediante PCR múltiplex con marcación doble para la amplificación de IFN- y GAPDH. Finalmente, se inmovilizan los amplicones biotinilados en MPs-estreptavidina, y se realiza el genosensado electroquímico para la detección de IFN- a través del otro marcador del cebador. Esta estrategia se propone como alternativa a los ensayos de liberación de IFN- que se usan en la actualidad para la identificación de la Tuberculosis. Por último, se presenta el diseño de un test de diagnóstico rápido, específico y altamente sensible basado en la amplificación isotérmica sobre MPs con detección electroquímica. Las técnicas de amplificación isotérmicas han surgido como una alternativa a la PCR para la identificación de microorganismos infecciosos, debido a la barrera que éstos últimos muestran para su implementación en entornos de bajos recursos. El último capítulo presenta la detección electroquímica de ADN usando sondas candado con amplificación isotérmica de círculo rodante y amplificación círculo a círculo. Esta estrategia ha demostrado ser una poderosa herramienta para la detección específica y sensible de ácidos nucleicos para su aplicación en el diagnóstico clínico. Los biosensores desarrollados en esta tesis representan una gran promesa para la detección de forma más rápida, simple y económica comparado con los métodos tradicionales de diagnóstico de enfermedades infecciosas. Además, las estrategias desarrolladas en esta tesis demuestran un gran potencial para su aplicación en entornos de bajos recursos.

Infectious diseases are becoming a major threat worldwide due to the fast dissemination and adaptation of pathogens favored by the unrestricted globalization. The primary role of diagnostics is to identify a disease. The rapid identification of a disease allows the patient to be placed on a specific antimicrobial therapy and avoid prolonged management on empiric, potentially inappropriate drug. Therefore, point-of-care (POC) devices that can reliably detect and/or monitor diseases would result in an improved care, and minimization of patient and societal cost of illness. Among them, electrochemical biosensors have the advantage of high sensitivity/specificity as well as simplicity of instrumentation, and can be easily expanded to multiplex detection platform. Furthermore, the integration of magnetic particles (MPs) in POC tests provides an even increased sensitivity and specificity due to the isolation and preconcentration of the target, whether MPs are modified with a specific recognition biomolecule. Modified-MPs can thus specifically bind the biomarkers and preconcentrate them from the complex specimen under magnetic actuation, preventing interferents before testing. Affordable emerging technologies requiring minimal training for final users, such as magnetic actuated electrochemical biosensors, are presented in this dissertation. Firstly, two simple diagnostic tests for CD4+ T lymphocytes quantification, directly in whole blood, and based on magnetic particles are presented. The assay is performed in an ELISA-like format for the optical detection or using graphite-epoxy electrodes for the electrochemical biosensing strategy. In both cases, the strategy has involved three main steps: a) immunomagnetic separation of CD4+ cells by antiCD3-MPs and labeling by using biotinylated antiCD4 antibody; b) enzymatic labeling; and c) detection based on the peroxidase activity. The dual labeling (CD3 and CD4 receptor) not only avoids interferences of other cells, but also increases the specificity of the assay. Thus, the development and evaluation of magnetic-actuated rapid HIV diagnostic platforms appropriate for their use in low resource settings for the following-up of patients under treatment is demonstrated. Secondly, an interferon- release assay based on electrochemical detection for interferon- transcript detection produced by isolated T lymphocytes is described. This approach also involves the integration of MPs for the isolation and preconcentration of three different targets (including whole T lymphocytes, mRNA transcripts and double-tagged DNA) in the same test. Accordingly, T lymphocytes are isolated from whole blood using antiCD3-MPs. Secondly, mRNA presenting poly(A) tail is preconcentrated on polydT-MPs from T lymphocyte. Afterward, mRNA is retrotranscripted and cDNA amplified by multiplex double-tagging PCR for the specific amplification of IFN- and GAPDH. Finally, one of the tags of the primers is used for the amplicons immobilization on streptavidin-MPs as support, while the electrochemical magneto-genosensing for transcript detection is performed using the other tag. This strategy results in an alternative for IFN- release assays, which can be used for identifying infectious states such as Tuberculosis. Finally, the design of a diagnostic test involving a rapid, specific and highly sensitive procedure based on isothermal amplification on MPs with electrochemical readout is presented. Isothermal amplification techniques are emerging as good candidates to replace PCR for the identification of infectious microorganism, since PCR-based method can be a critical barrier in low resource settings. An electrochemical DNA detection using padlock probes and the subsequent amplification with rolling circle and circle to circle amplification is presented in Chapter 6. This strategy has demonstrated to be a powerful combination for highly specific and sensitive nucleic acid detection that can be applied in clinical diagnosis. The electrochemical biosensors developed in this dissertation, offers considerable promise for obtaining information in a faster, simpler and cheaper manner compared to traditional methods for infectious disease diagnosis. Moreover, the strategies possess great potential in many applications, in low resource settings.