Phosphatidylserine-rich liposomes to tackle autoimmunity. En route to translationality

Abstract

Les malalties autoimmunitàries estan causades per defectes en la tolerància immunològica, i afecten a gairebé un 10% de la població. Darrerament, diverses intervencions mèdiques han convertit aquestes malalties en cròniques, però el seu diagnòstic encara comporta morbiditat i mortalitat elevades. Així, un repte biomèdic urgent és el desenvolupament de teràpies que puguin restablir selectivament la tolerància, aturin l’atac autoimmunitari i permetin la regeneració del teixit danyat. En condicions fisiològiques, la fagocitosi de cèl·lules apoptòtiques per part de fagòcits com les cèl·lules dendrítiques (CDs) —procés que rep el nom d’eferocitosi— els indueix propietats tolerogèniques i l’habilitat de restaurar la tolerància. Una demostració d’això és que una immunoteràpia cel·lular consistent en CDs tolerogèniques (CDtols) degut a l’eferocitosi de cèl·lules β apoptòtiques va aturar l’atac autoimmunitari contra les cèl·lules β en un model experimental de diabetis tipus 1 (DT1). Donades les dificultats en obtenir i estandarditzar cèl·lules β apoptòtiques autòlogues humanes per la seva implementació clínica, es va dissenyar una nanoteràpia basada en liposomes que simulen cèl·lules apoptòtiques. Les principals característiques d’aquestes vesícules sintètiques són: elevat percentatge de fosfatidilserina (FS) —fosfolípid característic de la membrana de les cèl·lules apoptòtiques—, diàmetre major de 500 nm, càrrega negativa i eficient encapsulació de pèptids d’insulina. Aquesta estratègia és tant efectiva en generar CDtols i aturar l’autoimmunitat contra les cèl·lules β com la immunoteràpia basada en cèl·lules apoptòtiques. La hipòtesi d’aquest treball és que els FS-liposomes poden restablir la tolerància en diverses malalties autoimmunitàries antigen-específiques mitjançant la generació de CDtols i l’expansió de limfòcits T reguladors, i que tenen el potencial translacional per abordar patologies autoimmunitàries humanes. L’objectiu principal d’aquest estudi ha estat caracteritzar globalment el potencial tolerogènic dels FS-liposomes. Amb aquesta finalitat, diferents pèptids autoantigènics rellevants en malalties autoimmunitàries s’han encapsulat en FS-liposomes de manera eficient i sense dificultats en mantenir el diàmetre i la càrrega, demostrant la versatilitat de l’estratègia a diferents patologies autoimmunitàries. En el model experimental de DT1, l’administració de FS-liposomes ha expandit clons de cèl·lules T CD4+ reguladores i T CD8+ que contribueixen a l’efecte tolerogènic de la teràpia a llarg termini. En el mateix model, s’ha demostrat la biocompatibilitat i seguretat del producte final donada la seva òptima tolerabilitat. D’altra banda, els FS-liposomes s’han adaptat al model d’esclerosi múltiple experimental simplement reemplaçant el pèptid encapsulat. En aquest model, els FS-liposomes han induït CDtols i han reduït la incidència i severitat de la malaltia correlacionant amb un increment en la freqüència de cèl·lules T reguladores, fet que valida el potencial dels FS-liposomes a constituir una plataforma per a la recuperació de tolerància en diferents malalties autoimmunitàries. Finalment, i de cara a una futura implementació clínica, s’han determinat els efectes de la teràpia en CDs humanes obtingudes de pacients amb DT1. En CDs de pacients adults, els FS-liposomes han estat fagocitats eficientment per les CDs amb una ràpida cinètica dependent de la FS, i això ha causat l’adquisició d’un transcriptoma, fenotip i funcionalitat tolerogènics similars als observats en els models experimentals. En CDs de pacients pediàtrics, però, les CDs han presentat defectes en la seva capacitat fagocítica correlacionant amb el temps de progressió de la malaltia; tanmateix, el seu fenotip i expressió de gens immunoreguladors després de la fagocitosi dels FS-liposomes són indicatius d’una habilitat tolerogènica òptima. En conclusió, la immunoteràpia liposomal descrita, que es basa en l’eferocitosi com a mecanisme inductor de tolerància, assoleix el mimetisme apoptòtic de manera simple, segura i eficient. A més, els liposomes ofereixen avantatges quant a producció i estandardització. Per tant, els FS-liposomes tenen potencial translacional i constitueixen una estratègia prometedora per recuperar la tolerància immunològica en malalties autoimmunitàries antigen-específiques.

Autoimmune diseases are caused by defective immunological tolerance, and reportedly affect up to 10% of the global population. In the last years, current medical interventions have transformed these disorders into chronic and manageable, but they still entail high rates of morbidity and mortality. Hence, there is an urgent need to develop therapies capable of restoring the breach of tolerance selectively, which halt the autoimmune aggression and allow the regeneration of the targeted tissue. In physiological conditions, the phagocytosis of apoptotic cells performed by phagocytes such as dendritic cells (DCs) —a process termed efferocytosis— prompts the acquisition of tolerogenic features and the ability to restore tolerance. Indeed, a cell immunotherapy consisting of DCs rendered tolerogenic (tolDCs) by apoptotic β-cell efferocytosis arrested the autoimmune attack against β-cells in an experimental model of type 1 diabetes (T1D). However, in light of the hurdles in obtaining and standardising human autologous apoptotic β-cells for its implementation in the clinics, a nanotherapeutic strategy based on liposomes mimicking apoptotic cells was designed. The fundamental characteristics of these synthetic vesicles are: a high percentage of phosphatidylserine (PS) —phospholipid unique to the apoptotic cell membrane—, diameter superior to 500 nm, negative charge and efficient encapsulation of insulin peptides. Importantly, this strategy was equally effective in inducing tolDCs and blunting β-cell autoimmunity as the immunotherapy based on apoptotic cells. The hypothesis of this work is that autoantigen-loaded PS-liposomes can re-establish tolerance in several antigen-specific autoimmune diseases through the induction of tolDCs and the expansion of regulatory T lymphocytes, and that they have translational potential to tackle human autoimmune disorders. The main aim of the present work has been to characterise the tolerogenic potential of PS-liposomes globally. To this end, different autoantigenic peptides relevant in autoimmune diseases have been efficiently encapsulated into PS-liposomes, without difficulties in preserving their appropriate diameter and charge, thus demonstrating the versatility of the therapy to different autoimmune pathologies. In the experimental model of T1D, the administration of PS-liposomes causes the expansion of clonal CD4+ regulatory T cells and CD8+ T cells, which contribute to the long-term re-establishment of tolerance. Moreover, in the same model, the biocompatibility and safety of the final product have been confirmed given its optimal tolerability. Furthermore, PS-liposomes have been adapted to the experimental multiple sclerosis model by merely replacing the encapsulated autoantigen. In this model, PS-liposomes elicit the generation of tolDCs and decrease the incidence and severity of the disease correlating with an increase in the frequency of regulatory T cells, a fact that validates the potential of PS-liposomes to serve as a platform for tolerance re-establishment in different autoimmune diseases. Finally, considering its future clinical implementation, the effect of the PS-liposomes therapy has been determined in human DCs obtained from patients with T1D. In DCs from adult patients, PS-liposomes are efficiently phagocyted by DCs with rapid kinetics dependent on the presence of PS, and this induces a tolerogenic transcriptome, phenotype and functionality that are similar to those observed in experimental models. However, DCs from paediatric patients display defects in their phagocytic capacity correlating with the time of disease progression, albeit their phenotype and immunoregulatory gene expression after PS-liposomes phagocytosis point to an optimal tolerogenic ability. In conclusion, the liposomal immunotherapy herein described, which is based on efferocytosis as a powerful tolerance-inducing mechanism, achieves apoptotic mimicry in a simple, safe and efficient manner. Additionally, liposomes offer advantages in terms of production and standardisation. Therefore, PS-liposomes possess translational potential and constitute an encouraging strategy to restore immunological tolerance in antigen-specific autoimmune diseases.