Lipid raft association and subcellular localization of UNC5 Netrin-1 receptors = Associació als lípids raft i localització subcel·lular de la familia de receptors de la Netrina-1 UNC5

Abstract

During brain development, UNC5 receptors play a key role in controlling axonal extension through their sensing of the guidance molecule Netrin-1. The correct positioning of receptors into specific cholesterol-enriched membrane raft microdomains is of crucial importance for the efficient transduction of the recognized signal. Whether such microdomains are required for the appropriate axonal guidance mediated by UNC5 receptors remains unknown. Here, we extend the classical biochemical characterization of raft microdomains by performing confocal microscopy, live cell FRAP analysis and sptPALM of fluorescently-tagged UNC5 receptors and we reveal for the first time differences into their membrane mobility properties. Using a combination of pharmacological and genetical approaches in primary neuronal cultures and brain cerebellar explants we further demonstrate that disrupting raft microdomains inhibit the chemorepulsive response of growth cones and axons against Netrin-1. Together, our findings indicate that the distribution of all UNC5 receptors into cholesterol-enriched raft microdomains is heterogeneous and that their specific localization have functional consequences for the axonal chemorepulsion against Netrin-1. Alternative splicing is a key mechanism in which a variety of proteins is achieved from "cut and paste" mRNA. The plethora of proteins resulting from alternative splicing processes is crucial for the proper function of certain protein isoforms. In this thesis we have detected alternative splicing in the UNC5A receptor in the nervous system. The resulting product is a UNC5A isoform that lacks the first TSPI repeat, uncovered here, to be important for cell membrane targeting. We have further analyzed the implications of losing the first TSPI repeat.

Durante el desarrollo del cerebro, los receptores UNC5 juegan un papel importante en el control de la extensión axonal, guiándose a través de la molécula guía Netrina-1. El posicionamiento específico de estos receptores en microdominios de membrana llamados 'lipid raft', son de crucial importancia en la transducción de señales. Si la asociación a estos microdominios es necesaria para los procesos de guía axonal mediados por los receptores UNC5, sigue aún por resolverse. En esta tesis vamos más allá de los clásicos ensayos de fraccionamiento de membrana, utilizando técnicas como microscopia confocal, microscopia de FRAP y microscopia de super resolución. Con estas técnicas hemos descubierto diferentes propiedades de estos receptores en cuanto a la movilidad lateral y la distribución subcelular. Más allá, mediante el uso de herramientas farmacológicas y genéticas en cultivos neuronales primarios y explantes cerebelares hemos hallado que desestabilizando estos microdominios de membrana la quimiorepulsión en conos de crecimiento y axones mediada por Netrina-1 queda inhibida. El 'splicing' alternativo es un mecanismo clave en el que una variedad de proteinas se consigue gracias al mecanismo de 'corta y pega' del mRNA. El abanico de proteínas de un mismo gen que se consigue a través de este proceso, es a menudo de vital importancia para algunas isoformas proteicas. En esta tesis hemos detectado que el receptor UNC5A sufre un 'splicing' alternativo en el sistema nervioso central. El producto resultante es una isoforma corta de UNC5A que carece del dominio extracelular TSPI, el cual es importante para la llegada de este receptor a la membrana celular. Además, hemos investigado cuales son las implicaciones de perder este dominio en las funciones que lleva a cabo UNC5A en la célula.