The Role of Microtubule nucleation during neural development

Abstract

The γ-­‐tubulin ring complex (γTuRC) is required to efficiently generate new microtubules (MT) in a process known as MT nucleation. In mitotic cells, MT nucleation by γTuRC occurs from the centrosome, in vicinity of the chromosomes and from the lattice of pre-­‐ existing MTs in a process additionally involving the augmin complex. In neurons, the centrosome loses its MT nucleation capacity, while the γTuRC can still promote nucleation elsewhere. Still, it remains unclear how the γTuRC is regulated in these cells and whether other non-­‐centrosomal sites function as microtubule-­‐organizing centre in neurons.

The aim of this thesis is to understand how MT nucleation mediated by augmin and γTuRC contributes to brain development and how nucleation is regulated during this process.

In this thesis we show that the augmin complex is required for both axonal and dendritic development in vitro. In the axon, augmin guarantees that MTs are nucleated with the correct orientation, ensuring uniform axonal MT polarity. On the other hand, augmin depletion leads to an overall decrease in MT density in dendrites with no major effect on their polarity. Surprisingly, despite our findings, analysis of augmin function by other groups in vivo in flies and zebrafish has not revealed any dramatic defects.

Strikingly, we show that, in conditional KO mice with gene deletion in the augmin subunit Haus6 in neural progenitors, brain development is halted before embryonic day 13 and the animals die at birth. These major brain defects are caused by impaired mitosis and massive cell death in neuroprogenitors, indicating significant, species-­‐specific differences in the requirement for augmin function.

In the last part of this thesis we identified KIF2A and CEP170 as γTuRC interactors in in vitro cultured mouse cortical neurons and we show that, in agreement with published data on KIF2A function, CEP170 seems to inhibit growth of axon collateral branches. We speculate that KIF2A and CEP170 may function as negative regulators of microtubules nucleation by γTuRC.

Together these results establish augmin-­‐mediated nucleation as essential for mammalian brain development and provide first insight in the regulation of microtubule nucleation in neurons by γTuRC interactors.

El complejo de anillo gamma-­‐tubulina (γTuRC) es necesario para generar microtúbulos de manera eficiente en un proceso conocido como nucleación de microtúbulos. En células mitóticas, la nucleación a partir del γTuRC tiene lugar en el centrosoma, en regiones próximas a los cromosomas y en la superficie de microtúbulos previamente formados, en un proceso que requiere adicionalmente la presencia del complejo de augmina. A pesar de que en neuronas el centrosoma pierde su capacidad nucleadora de microtúbulos, el γTuRC aún puede inducir la nucleación en otros lugares. Sin embargo, aún se desconoce cómo se regula el γTuRC en estas células y si, aparte del centrosoma, existen otros lugares que puedan funcionar como centros organizadores de microtúbulos.

El objetivo de esta tesis doctoral es entender cómo la nucleación de microtúbulos dependiente de augmina y del γTuRC contribuyen al desarrollo cerebral y cómo se regula la nucleación de microtúbulos durante este proceso.

En esta tesis hemos demostrado que el complejo de augmina es necesario para el desarrollo de axones y dendritas in vitro. En el axón, augmina garantiza que los microtúbulos se nucleen en una orientación adecuada, asegurando una polaridad microtubular uniforme a lo largo del axón. Por otro lado, la ausencia de augmina causa una disminución general en la densidad de microtúbulos de las dendritas, sin afectar a su polaridad. Sorprendentemente, a pesar de nuestros descubrimientos, otros grupos han analizado la función de augmina in vivo (en moscas y pez cebra) sin encontrar ningún defecto significativo.

Curiosamente, hemos observado que, en ratones knockout condicionales en los que la subunidad Haus6 de augmina ha sido delecionada de progenitores neuronales, el desarrollo cerebral se interrumpe antes del decimotercer día del desarrollo embrionario. Adicionalmente, esta condición resulta letal para los animales, que mueren durante el nacimiento. Se ha encontrado que las causas de estos dramáticos defectos cerebrales son problemas en mitosis y una muerte masiva de neuroprogenitores. Estos resultados indican que existen diferencias en el requerimiento de augmina entre diferentes especies.

En la última parte de esta tesis identificamos KIF2A y CEP170 como interactores del γTuRC en neuronas corticales de ratones cultivadas in vitro. También demostramos que, en concordancia con datos publicados sobre KIF2A, CEP170 parece inhibir el crecimiento de ramificaciones laterales en axones. Nuestra hipótesis es que tanto KIF2A como CEP170 podrían actuar como reguladores negativos de la nucleación de microtúbulos dependiente de γTuRC.

En conclusión, estos resultados demuestran que la nucleación dependiente de augmina es un proceso esencial en el desarrollo cerebral humano, y proporcionan una primera visión de cómo interactores del γTuRC pueden regular la nucleación de microtúbulos en neuronas.