Role of tRNA modifications in the synthesis of the extracellular matrix

Abstract

Transfer RNAs (tRNAs) are key adaptor molecules that mediate decoding of messenger RNAs (mRNAs) into proteins by complementary pairing of their anticodons with mRNA codons. tRNAs that undergo adenosine to inosine editing at the wobble base, or position 34, display expanded codon decoding capacity as inosine enables pairing not only with uridine, but also with cytosine and adenosine. The essential heterodimeric enzyme Adenosine Deaminase Acting on Transfer RNA (ADAT) catalyzes this post-transcriptional modification in eukaryotes and is comprised of subunits ADAT2 and ADAT3. Emergence of heterodimeric ADAT has been proposed to have shaped both tRNA gene content and codon composition of eukaryotic genomes in such a way that these two features became mirrored. Although the exact contribution of wobble inosine (I34) to translation elongation has not been established, previous reports have suggested that it might play a role in improving translational efficiency and accuracy of genes enriched in codons recognized by I34-modified tRNAs.

To further understand the role of the inosine modification in translation, we generated cell lines depleted in the catalytic subunit ADAT2. Silencing of ADAT2 lead to impaired cellular proliferation and had a variable impact on the expression of genes coding for extracellular matrix (ECM) proteins such as mucins. Notably, ADAT2 deficiency did not have major effects on the post-translational glycosylation of mucins, neither did it trigger the unfolded protein response. Supported by the absence of clear defects in decoding rates in ADAT2 depleted cells, as measured by ribosome profiling, our findings suggest that a reduced pool of I34-modified tRNAs might suffice to carry out cellular functions in steady-state conditions. However, we found that, under circumstances involving a high demand for these tRNAs such as airway remodeling, ADAT2 is required for the proper translation of an ECM gene enriched in stretches of codons read by I34-tRNAs. Taken together, our results suggest that the inosine modification is particularly relevant for the synthesis of ECM proteins during specialized processes including neural development and airway remodeling.

The importance of the inosine modification has been recently underscored by the identification of pathogenic mutations in the gene encoding ADAT3, all of which share common neurodevelopmental phenotypes. The most prevalent mutation identified to date is a valine to methionine (V144M) substitution that is linked to intellectual disability and strabismus. In the present study we characterized human ADAT in terms of activity and quaternary structure, and investigated the effect of the ADAT3 V144M mutation on the enzyme. We showed that the V144M substitution leads to decreased enzymatic activity of ADAT, which might result from alterations in the tertiary structure and subcellular localization of ADAT3 that were found to be associated to the mutation.

Els ARNs de transferència (ARNt) són molècules que tenen un paper clau en el procés de traducció dels ARN missatgers (ARNm) en proteïnes mitjançant la interacció del seu anticodó amb codons d’ARNm. Els ARNt que passen per un procés d’edició d’adenosina a inosina a la base wobble, o posició 34, són capaços de llegir més d’un codó d’ARNm gràcies a la capacitat de la inosina de reconèixer els tres nucleòtids uridina, citidina i adenosina. L’enzim responsable d’aquesta modificació post-transcripcional en eucariotes s’anomena Adenosina Deaminasa específica per l’ARNt (ADAT), es tracta d’un complex heterodimèric format per les subunitats ADAT2 i ADAT3 que és essencial per a la viabilitat de l’organisme. Estudis previs han proposat que l’aparició d’ADAT va determinar el nombre de còpies gèniques de cada ARNt així com la composició de codons presents als genomes eucariòtics de tal manera que aquests dos factors estiguessin mútuament balancejats. Tot i que la contribució precisa de la inosina 34 (I34) a la traducció de proteïnes durant la fase d’elongació encara s’ha determinat experimentalment, algunes investigacions han suggerit que podria jugar un rol en l’eficiència i fidelitat de traducció de gens enriquits en codons reconeguts per ARNt modificats amb I34.

Amb l’objectiu d’investigar el rol de la inosina en la traducció, hem generat línies cel·lulars on el gen codificant per ADAT2 ha estat silenciat. La depleció d’ADAT2 comporta un retard en el creixement cel·lular i té un efecte variable en l’expressió gènica de proteïnes de la matriu extracel·lular. El patró de modificacions post-traduccionals de glicosilació d’aquestes proteïnes no resulta alterat per la deficiència d’ADAT2, que tampoc activa la resposta a proteïnes desplegades. Juntament amb l’absència de defectes en la velocitat d’elongació analitzada per ribosome profiling, aquestes observacions suggereixen que la cèl·lula és capaç de dur a terme les seves funcions amb un nombre reduït d’ARNt modificats amb inosina. Hem vist, però, que en condicions que requereixen majors quantitats d’ARNt inosinats, la depleció d’ADAT2 dóna lloc a la traducció ineficient d’un gen de matriu extracel·lular altament enriquit en codons sensibles llegits per ARNt modificats. Així doncs, els nostres resultats indiquen que la inosina pot exercir un rol important en la síntesi de proteïnes de la matriu extracel·lular, particularment durant processos de desenvolupament neuronal i de remodelat de les vies respiratòries.

La rellevància de la modificació I34 s’ha vist reforçada recentment per la identificació de mutacions de caire patogènic localitzades al gen que codifica ADAT3. Totes elles tenen en comú la presència de fenotips relacionats amb el desenvolupament neurològic. La mutació d’ADAT3 més comuna consisteix en la substitució d’un residu valina per un metionina (V144M) i està associada a la manifestació de discapacitat intel·lectual i estrabisme. En el present estudi hem caracteritzat l’activitat enzimàtica i l’estructura quaternària de l’ADAT humà, així com l’impacte de la mutació V144M d’ADAT3 en el complex heterdimèric. Els nostres revelen que la substitució V144M dóna lloc a una menor activitat enzimàtica d’ADAT. És possible que aquesta reducció es vegi influïda per les alteracions en l’estructura terciària i en la localització cel·lular d’ADAT3 que indueix la mutació.