Intrinsic osteoinduction and osteogenesis of biomimetic calcium phosphate scaffolds with different nano-, micro- and macroporosities : ectopic and orthotopic implantation in a canine model

Abstract

The development of synthetic bone substitutes with enhanced osteogenic properties is urged by the global ageing population. Sintered calcium-phosphate (CaP) ceramics are the most widely used synthetic biomaterials for bone regeneration. However, their clinical performance is inferior to those of autografts, which are still considered the gold standard, despite the serious drawbacks associated with the need of a harvesting surgery. This thesis aims at providing new insights in the development of CaP biomaterials with osteoinductive properties, this is, with the capacity to foster the differentiation of mesenchymal stem cells to bone forming cells, without the need of adding exogenous growth factors. Previous studies pointed to chemical composition, macropore architecture, microstructural topography and specific surface area (SSA) as critical factors in the intrinsic osteoinduction of biomaterials. However, only sintered ceramics with a limited range of porosities and low SSAs had been analyzed so far. In the present thesis, we were able to extend this range to the nanoscale by using biomimetic low-temperature processing routes. Foaming and 3D-printing methods allowed producing biomimetic CaP scaffolds with tailored macropore architectures together with controlled micro and nanoporosity and, hence, high SSAs. In order to evaluate the intrinsic osteoinduction of this new family of biomimetic bone substitutes, nanostructured calcium deficient hydroxyapatite (CDHA) scaffolds with needle-like crystal morphology were implanted intramuscularly in a canine model, and compared with two sintered ceramics, namely biphasic calcium phosphate and beta-tricalcium phosphate (Study I). The results showed that the high reactivity of nanostructured biomimetic CDHA, combined with a spherical concave macroporosity of foamed scaffolds, accelerated and enhanced the osteoinduction potential beyond the limits of conventional, microstructured, sintered ceramics. As a second step, the effect of macropore geometry of nanostructured CDHA on the bone healing capacity was analyzed. The same foamed and 3D-printed CDHA scaffolds were implanted intraosseoulsy in a canine model (Study II). Whereas nanostructured CDHA was shown to be highly osteoconductive irrespective of macropore geometry, a superior osteogenic capacity was observed in the foamed scaffolds, which correlated well with the higher intrinsic osteoinductive potential demonstrated previously. Moreover, foams showed a higher cell-mediated degradation than the 3D-printed constructs, with a simultaneous and progressive replacement of the scaffold by new bone, demonstrating that the control of macropore architecture allows tuning both material degradation and new bone formation. Finally, aiming to further mimic the natural bone apatite, the effect of nanocrystal morphology (plate vs. needle) and carbonate doping on the intrinsic bioactivity of biomimetic CDHA was investigated. To this end, CDHA foams with different nanostructures (Coarse/Fine-CDHA) and carbonated CDHA foams were compared, both in canine ectopic and orthotopic implantation models (Study III). Fine-CDHA foams showed a superior osteoinduction and bone healing potential, as well as a higher degradation than Coarse-CDHA foams, suggesting that there is a threshold value in terms of SSA necessary to activate the cell-mediated resorption and the associated osteoinduction, which determines in turn the osteogenic capacity of the materials in a bony enviroment. Moreover, carbonate dopping of CDHA accelerated both intrinsic osteoinduction and bone healing, simultaneously increasing the cell-mediated resorption. Thus, the increased biomimetism of CDHA allowed the material to enter the natural bone remodelling cycle, this resulting in a tight synchronization between material degradation and bone formation, and ultimately, obtaining bone substitutes with enhanced bone regeneration potential.

L’envelliment global de la població exigeix el desenvolupament de nous substituts ossis sintètics amb capacitats osteogèniques optimitzades. Tot i que les ceràmiques de fosfats de calci (CaP) sinteritzades són els biomaterials sintètics més utilitzats en regeneració òssia, la seva eficiència és inferior a la dels empelts d’ós autòleg, els quals continuen sent el tractament de primera elecció malgrat presentar inconvenients importants associats a la necessitat d’una segona cirurgia. Aquesta tesi té com a objectiu optimitzar el desenvolupament de biomaterials de CaP amb propietats osteoinductives, fet que estimula la diferenciació de cèl·lules mare mesenquimals a cèl·lules osteogèniques, sense l’ús de factors de creixement exògens. Estudis recents han identificat diferents factors crítics en l’osteoinducció intrínseca dels biomaterials com ara la composició química, la macroporositat, la microestructura i la superfície específica (SSA). Fins al moment, només s’han analitzat ceràmiques sinteritzades amb un rang limitat de porositats i SSAs. Tanmateix, en la present tesi s’ha aconseguit augmentar aquest rang a la nanoescala per mitjà de rutes de processament biomimètiques a baixes temperatures. L’escumat i la impressió 3D de CaP biomimètics, ha permès l’obtenció d’implants amb arquitectures macroporoses específicament modulades conjuntament amb micro i nanoporositats controlades, i per tant, amb SSAs significativament superiors. Per tal d'avaluar l'osteoinducció intrínseca d'aquests nous materials biomimètics, es van implantar intramuscularment materials nanoestructurats (cristalls tipus agulla) de hidroxiapatita deficient en calci (CDHA) en un model caní, i es van comparar amb dues ceràmiques sinteritzades (Estudi I). Els resultats van mostrar que la gran reactivitat de la CDHA nanoestructurada, combinada amb una macroporositat esfèrica còncava de les escumes, van incrementar el potencial d'osteoinducció més enllà dels límits oferts per les ceràmiques sinteritzades microestructurades. El segon pas va consistir en l’anàlisi de l'efecte de la geometria de la macroporositat dels materials de CDHA sobre la seva capacitat de consolidació òssia, implantant els materials escumats i els impresos en 3D a nivell intraossi en un model caní (Estudi II). Tot i que la CDHA nanoestructurada va demostrar ser altament osteoconductiva independentment de la geometria macroporosa, les escumes van mostrar una capacitat osteogènica superior, correlacionant-se directament amb el major potencial osteoinductiu intrínsec demostrat anteriorment. A més, les escumes van mostrar una reabsorció cel·lular superior als implants obtinguts per impressió 3D, substituint progressivament el material per nou os i, demostrant així que el control de l'arquitectura de la macroporositat permet adequar tant la degradació del material com fomentar la regeneració òssia. Finalment, amb l'objectiu de mimetitzar encara més la fase mineral òssia, es va investigar l’efecte de la morfologia dels nanocristalls (placa vs. agulla) i del dopatge amb ions carbonat sobre la bioactivitat intrínseca de la CDHA biomimètica, implantant escumes de CDHA amb diferents nanoestructures (Coarse/Fine-CDHA) i escumes carbonatades a nivell ectòpic i ortotòpic en gos (Estudi III). Les escumes Fine-CDHA van mostrar un potencial osteoinductiu i osteogènic superiors, i una degradació incrementada respecte a les escumes Coarse-CDHA, suggerint que existeix una SSA mínima per activar la degradació cel·lular dels materials i la conseqüent resposta osteoinductiva, fet que determina la capacitat osteogènica dels materials en un defecte ossi. La carbonatació de la CDHA va accelerar tant el potencial osteoinductiu i osteogènic, com la degradació cel·lular dels materials, suggerint que l’increment del biomimetisme de la CDHA afavoreix la introducció del material dins del cicle de remodelació òssia