Desarrollo y Evaluación de técnicas de PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de Anisakis (Nematoda, Anisakidae) en pescado y productos procesados

Abstract

La presencia de nematodos del género Anisakis en pescado representa un peligro potencial para los consumidores por su capacidad de causar patología a nivel gastrointestinal y/o reacciones alérgicas. Es importante desarrollar métodos de detección y cuantificación específicos que permitan preservar la calidad e inocuidad del pescado y de sus productos derivados. Se optimizaron técnicas de SYBR Green qPCR y TaqMan qPCR utilizando los cebadores ANIKIT y QCYTCII que amplifican un fragmento de ITS-1 y Cox-2, respectivamente. Para analizar la especificidad y sensibilidad, se aislaron larvas de pescados como la bacaladilla, el rape y el jurel (Atlántico NE y Mediterráneo Oeste), identificadas morfológicamente como Anisakis simplex sensu lato (s.l.) (n=510), Anisakis physeteris (n=3), Hysterothylacium sp. (n=283) y Pseudoterranova sp (n=1). Larvas del complejo A. simplex (s.l.) fueron analizadas por PCR-RFLP para identificar las especies gemelas Anisakis simplex sensu stricto y Anisakis pegreffii. Para los análisis de linealidad, reproducibilidad y sensibilidad, se construyó un sistema binario, contaminando experimentalmente una matriz alimentaria con larvas lisadas de A. simplex (s.l.), en concentraciones de 1,36 x104 a 1,36 x10-3 ng de ADN de Anisakis por gramo. Los estudios de especificidad indicaron que los cebadores ANIKIT amplifican las larvas de Anisakis y Pseudoterranova, mientras que los cebadores QCYTCII fueron específicos para Anisakis. Se observó un comportamiento lineal desde la concentración 1,36 x104 a 1,36 x10-1 ng de ADN de A. simplex (s.l.) por gramo para los tres métodos. Después de un análisis PROBIT, el límite de detección (LOD 95%) para ANIKIT y QCYTCII SYBR Green qPCR fue de 0,18 y 0,30 ng/g respectivamente, similar a 0,25 ng/g reportado por TaqMan qPCR. Se seleccionó la técnica QCYTCII SYBR Green qPCR para estudiar la presencia de Anisakis en alimentos procesados derivados del pescado, analizándose 180 muestras de gulas, croquetas, palitos de cangrejo y hamburguesas de 15 marcas comerciales. Se detectó ADN de Anisakis en 4/5 marcas de gulas, 1/3 de croquetas y 4/6 de palitos de cangrejo, encontrándose las mayores concentraciones, aunque a nivel de trazas, en gulas y palitos de cangrejo (5,38±0,72 y 4,46±0,77 ng/g). Se desarrolló un modelo matemático descriptivo- QCYTCII SYBR Green qPCR para estimar el número de larvas de Anisakis en pescado Para ello, se contaminaron experimentalmente filetes de merluza con diferente número de larvas (0-50) de A. simplex (s.l.). Se observó una relación logarítmica entre los valores Cq y el número de larvas presentes en la muestra obteniendo una función descriptiva (Cq= -1,529x + 24,109) (R2 =0,9908; CV=2,37%). El modelo se validó con el estudio de la carga parasitaria de 25 bacaladillas del Atlántico NE, analizadas en paralelo por inspección visual, observándose una concordancia del 95% entre el número de larvas observadas visualmente y el número de larvas estimado por el modelo. Por otro lado, el estudio de la parasitación de boquerones del Atlántico NE, 30 de la costa de Portugal y 30 del Golfo de Vizcaya, fue realizado utilizando en la mitad de los especímenes de cada zona el modelo descriptivo desarrollado y en la otra mitad la inspección visual, sin encontrase diferencias significativas (P=0,77).

The presence of Anisakis nematodes in consumed fish represents a potential hazard as they can provoke gastrointestinal symptoms and allergic reactions. The development of detection and quantification methods for Anisakis is important to ensure the safety of fish and derived products. SYBR Green and TaqMan were optimized using ANIKIT and QCYTCII primers, amplifying ITS-1 and Cox-2, respectively. Larvae of Anisakis simplex sensu stricto, Anisakis pegreffii, Anisakis physeteris, Hysterothylacium sp. and Pseudoterranova sp. were used for optimization. For linearity and sensitivity analyses, a binary system was constructed, spiking a food matrix with lysed larvae of A. simplex sensu lato at concentrations from 1.36x104 to 1.36x10-3 ng of A. simplex (s.l.) DNA/g. ANIKIT primers amplified Anisakis and Pseudoterranova, while QCYTCII primers were specific for Anisakis. A linear behavior was observed from 1.36x104 to 1.36x10-1 ng of A. simplex DNA/gram. The SYBR Green qPCR detection limit was 0.18 (ANIKIT) and 0.30 (QCYTCII) ng/g, similar to 0.25 ng/g for TaqMan. The QCYTCII SYBR Green qPCR was selected for the analysis of commercial fish-derived foods. Anisakis DNA was detected in 4/5 of “gula”, 1/3 of croquette and 4/6 of crab stick brands, the highest concentrations being found in “gulas” and crab sticks (5.38±0.72 and 4.46±0.77 ng/g). A descriptive model was developed based on the QCYTCII SYBR Green qPCR technique to estimate the number of Anisakis larvae in fish. Hake fillet samples were experimentally contaminated with different numbers of A. simplex (s.l.) larvae (0-50). A logarithmic relationship was observed between the Cq values and the number of larvae present, generating a descriptive function (Cq=-1.529x+24.109) (R2=0.9908; CV=2.37%). The model was validated in a study of 25 specimens of NE Atlantic blue whiting that underwent a parallel visual inspection, a 95% agreement between the number of observed and estimated larvae was obtained. The descriptive model was then applied to analyze NE Atlantic anchovies, 30 from the coast of Portugal and 30 from the Bay of Biscay. The number of larvae present in half the specimens from each zone was estimated by the descriptive model, the other half were inspected visually, no significant differences were found (P=0.77).