Cytoplasmic cyclin D1 roles in neurons: effects on neuritogenesis and type A GABA receptors

Abstract

Ciclina D1 i la quinasa Cdk4 formen un complex que és regularment conegut pel seu paper dintre del nucli regulant el cicle cel·lular. D’altra banda, ciclina D1 exerceix funcions no canòniques relacionades amb la transcripció, la reparació de l’ADN, la diferenciació i el metabolisme. En el nostre grup hem demostrat que ciclina D1 en el citoplasma regula la invasió cel·lular i la metàstasi a través de la fosforilació de paxilina. Els ratolins knockout de ciclina D1 presenten deficiències neuronals. Ciclina D1 s’ha trobat al citoplasma de neurones diferenciades i és necessària per al creixement de neurites induït per NGF en cèl·lules PC12. Així doncs, ens hem proposat explorar les funcions de ciclina D1 citoplasmàtica en neurones. Aquí demostrem que els complexos ciclina D1-Cdk són importants per al creixement inicial de neurites en neurones corticals embrionàries. La sobreexpressió de ciclina D1 o Cdk4 promou el creixement de l’axó i les neurites, mentre que una disminució dels nivells de ciclina D1 endògena inhibeix la neuritogènesi en neurones corticals en cultiu. Els nostres resultats assenyalen paxilina com a efector downstream de ciclina D1 en aquest procés ja que el mutant no fosforilable de paxilina comporta una disminució de les longituds de l’axó i les neurites. També ens hem centrat en la regulació dels receptors de GABA tipus A per part de ciclina D1. GABA és el principal neurotransmissor inhibitori del cervell dels mamífers, exercint les seves accions a través de la seva unió als receptors de GABA. Tant la funció com l’abundància dels receptors ionotròpics GABAA sovint són regulades per la fosforilació del bucle intracel·lular de les seves subunitats. Aquí descrivim que ciclina D1 interacciona directament amb les subunitats α4 i β3 dels GABAARs, i que colocalitza i coimmunoprecipita amb la subunitat α4 a l’hipocamp de ratolí adult. A més, hem demostrat que el complex ciclina D1-Cdk4 fosforila α4 en els residus T423 i S431, i que, tant ciclina D1 com un al·lel fosfomimètic d’α4 prevenen la pèrdua de funcionalitat (run-down) dels GABAAR en cèl·lules HEK tsA201. Finalment, la inhibició dels complexos ciclina D1-Cdk4/6 mitjançant Palbociclib revela que aquests complexos són necessaris per a mantenir els corrents tònics de GABA així com els corrents postsinàptics miniatura en l’hipocamp. Globalment, els nostres resultats suggereixen nous papers de ciclina D1 citoplasmàtica en el sistema nerviós central, regulant la neuritogènesi i l’activitat neuronal a través dels receptors tipus A de GABA. Això podria aclarir el fenotip del ratolí mancat de ciclina D1 i ser rellevant per a comprendre diferents desordres mentals en els que la desregulació de la inhibició GABAèrgica n’és un factor determinant.

Ciclina D1 y la quinasa Cdk4 forman un complejo que es comúnmente conocido por su papel dentro del núcleo, regulando el ciclo celular. Por otro lado, ciclina D1 ejerce funciones no canónicas relacionadas con la transcripción, la reparación del ADN, la diferenciación y el metabolismo. En nuestro grupo hemos demostrado que ciclina D1 en el citoplasma regula la invasión celular y la metástasis a través de la fosforilación de paxilina. Los ratones knockout de ciclina D1 presentan deficiencias neuronales. Ciclina D1 se ha encontrado en el citoplasma de neuronas diferenciadas y es necesaria para el crecimiento de neuritas inducido por NGF en células PC12. Así pues, nos hemos propuesto explorar las funciones de ciclina D1 citoplasmática en neuronas. Aquí mostramos que los complejos ciclina D1-Cdk son importantes para el crecimiento inicial de neuritas en neuronas corticales embrionarias. La sobreexpressión de ciclina D1 o Cdk4 promueve el crecimiento del axón y las neuritas, mientras que una disminución de los niveles ciclina D1 endógena inhibe la neuritogénesis en neuronas corticales en cultivo. Nuestros resultados señalan paxilina como efector downstream de ciclina D1 en este proceso puesto que el mutante no fosforilable de paxilina conlleva una disminución de la longitud del axón y de las neuritas. Además, nos hemos centrado en la regulación de los receptores de GABA tipo A por parte de ciclina D1. GABA es el principal neurotransmisor inhibidor del cerebro de los mamíferos, ejerciendo sus acciones a través de su unión a los receptores de GABA. Tanto la función como la abundancia de los receptores GABAA ionotrópicos a menudo son reguladas por la fosforilación del bucle intracelular de sus subunidades. Aquí describimos que ciclina D1 interacciona directamente con las subunidades α4 y β3 de los GABAARs, y que colocaliza y co-inmunoprecipita con la subunidad α4 en el hipocampo de ratón adulto. Además, hemos demostrado que el complejo ciclina D1-Cdk4 fosforila α4 en los residuos T423 y S431 y que, tanto ciclina D1 como un alelo fosfomimético de α4 previenen la pérdida de funcionalidad (run-down) de los GABAAR en células HEK tsA201. Finalmente, la inhibición de los complejos ciclina D-Cdk4/6 mediante Palbociclib revela que estos complejos son necesarios para mantener las corrientes tónicas de GABA así como las corrientes postsinápticas miniatura en el hipocampo. Globalmente, nuestros resultados sugieren nuevos roles de ciclina D1 citoplasmática en el sistema nervioso central, regulando la neuritogénesis y la actividad neuronal a través de los receptores tipo A de GABA. Esto podría esclarecer el fenotipo del ratón con carencia de ciclina D1 y ser relevante para comprender diferentes desórdenes mentales en los que la desregulación de la inhibición GABAérgica es un factor determinante.

Cyclin D1 and its kinase partner Cdk4 form a complex which is well known for its nuclear role regulating the cell cycle. In addition, non-canonical functions of cyclin D1 are related to transcription, DNA damage repair, differentiation and metabolism. Also, our group has demonstrated a cytoplasmic role of cyclin D1 in cell invasion and metastasis through the phosphorylation of paxillin. Cyclin D1 knockout mice show neurological deficiencies. Cyclin D1 has been found at the cytoplasm of differentiated neurons, and is required for NGF-induced neurite outgrowth in PC12 cells. Hence, we have aimed to explore cyclin D1 cytoplasmic functions in neurons. Here we show that cytoplasmic cyclin D1-Cdk complexes are important for early neurite outgrowth in embryonic cortical neurons. Overexpression of cytoplasmic cyclin D1 or Cdk4 promotes axon and neurite outgrowth, while downregulation of endogenous cyclin D1 inhibits neuritogenesis in cultured cortical neurons. Our data point to paxillin as a downstream effector of cyclin D1 in this process since a non-phosphorylatable mutant of paxillin results in a decrease in axon and neurite lengths. We have also focused on the regulation of type A GABA receptors by cyclin D1. GABA is the main inhibitory neurotransmitter in the mammalian brain, exerting its actions by binding and activating the so-called GABA receptors. Ionotropic GABAAR function and abundance are often regulated by phosphorylation at the intracellular loop of its subunits. Here we describe that cyclin D1 directly interacts with the α4 and β3 subunits of GABAA receptors, and colocalizes and co-immunoprecipitates with the α4 subunit at the hippocampus of adult mice. Moreover, we prove that the cyclin D1-Cdk4 complex phosphorylates α4 at T423 and S431, and that cyclin D1 or a phosphomimetic allele of α4 prevent GABAAR run-down in HEK tsA201. Finally, the inhibition of cyclin D-Cdk4/6 complexes by Palbociclib reveals that these complexes are necessary for maintaining GABA-tonic currents and miniature inhibitory postsynaptic currents in hippocampal slices. Taken together, our results strongly suggest new roles for cytoplasmic cyclin D1 in the central nervous system, regulating early neuritogenesis and neuronal activity through GABAA receptors. This may shed light on the neurological phenotype of the cyclin D1 knockout mice and be relevant for several mental disorders wherein dysregulation of GABA inhibitory functions may be a determining factor.