Potential of LC-(Q)TOF MS in target and non-target analyses: wide scope screening of organic contaminants and metabolomic applications

Abstract

En la presente tesis se ha investigado el potencial de la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas de alta resolución en aproximaciones analíticas tanto de tipo target (análisis de compuestos diana) como non-target (análisis no dirigido). Las ventajas que este tipo de instrumentación ofrece, derivadas de la adquisición del espectro completo con alta resolución y medidas de masa exacta, la hacen idónea para el screening de contaminantes orgánicos así como para estudios metabolómicos tanto de denominación de origen de alimentos como de carácter biomédico. El trabajo presentado se ha estructurado en tres grandes bloques. En el primero de ellos se aborda el desarrollo y optimización de un método de screening “universal” de contaminantes orgánicos usando un acoplamiento instrumental LC-QTOF MS. Con este fin, se ha desarrollado una base de datos de compuestos, se ha optimizado la metodología analítica y, finalmente, se ha validado dicha metodología en matrices medioambientales. El segundo bloque muestra el potencial de la técnica para la investigación y diagnosis en exhalados pulmonares, los cuales presentan un bajísima concentración de metabolitos. En el tercer y último bloque, se lleva a cabo la búsqueda de compuestos que puedan utilizarse como marcadores de D.O. en muestras de naranja y vino, centrándose especialmente en aquellas pertenecientes a la Comunidad Valenciana. El primer bloque se inicia con la optimización de los parámetros instrumentales que puedan tener un efecto notorio en la creación de la base de datos y/o en el análisis de las muestras. Para ello, se han investigado los factores que afectan a la sensibilidad instrumental y a la exactitud de masa. Además, se estudia la fragmentación de los compuestos incluidos en la base de datos con el fin de facilitar de forma automática y simultánea la confirmación de la identidad de los compuestos detectados en las muestras. Finalmente se ha evaluado la influencia de la resolución de masa y cromatográfica en la exactitud de masa en el caso de matrices complejas. Posteriormente, se han creado dos bases de datos de contaminantes orgánicos: una teórica, la cual contiene alrededor de 1000 contaminantes orgánicos reportados en la literatura como analizables por LC-MS. Esta base de datos incluye tiempo de retención y fórmula empírica de fragmentos y aductos de aquellos compuestos de los que se dispone de patrones de referencia y que han sido inyectados de acuerdo con los parámetros previamente optimizados. La segunda base de datos se trata de una librería de espectros experimental que contiene los espectros a alta y baja energía de colisión (estos últimos proporcionando información sobre la fragmentación), así como tiempos de retención, de los compuestos con patrón disponible. Finalmente, se ha evaluado la eficacia de la librería en el análisis de muestras reales. En un segundo trabajo se evalúa el potencial de los dos principales procedimientos para la investigación de contaminantes orgánicos mediante métodos de screening: non-target y post-target. Para ello, se lleva a cabo un screening de muestras ambientales, alimentos y muestras de interés toxicológico mediante las dos metodologías y se comparan los resultados obtenidos. La primera aproximación (non-target), basada en la deconvolución del cromatograma para la búsqueda de componentes en la muestra, ha demostrado una notable dependencia de la intensidad del pico cromatográfico debido a la baja eficiencia del algoritmo de deconvolución. En el caso de la aproximación non-target, tras la búsqueda de los componentes, los espectros correspondientes son automáticamente comparados con la librería de espectros experimental creada anteriormente, así como con una librería teórica generada a partir de los compuestos incluidos en la base de datos de contaminantes. En cuanto a la segunda aproximación, tipo post-target, esta se basa en la búsqueda, después de la inyección de las muestras, de compuestos seleccionados (target) incluidos en la base de datos. Como se ha indicado anteriormente, ésta incluye información de fragmentación y tiempo de retención de aquellos compuestos con patrón de referencia disponible, es decir aquellos que están también presentes en la librería experimental de espectros. A la vista de los resultados, se concluye que la aproximación post-target resulta la más ventajosa para abordar un screening “universal” de un elevado número de compuestos. Además, los procesos de revisión de datos y los tiempos de procesamiento se reducen considerablemente. Sin embargo, la metodología non-target presenta una excelente capacidad de confirmación de la identidad de los contaminantes encontrados ya que facilita la comparación de los espectros de fragmentación de patrones con los obtenidos en la muestra. Mediante la aproximación post-target, se encontró un importante número de contaminantes en muestras ambientales y alimentarias, así como drogas de abuso y fármacos en las muestras de orina de voluntarios en tratamientos de desintoxicación. El primer bloque de la tesis finaliza con una validación cualitativa de la metodología desarrollada en muestras de agua subterránea, superficial y el efluente de una planta de tratamiento de aguas residuales. Se han evaluado dos tipos de relleno en la extracción en fase sólida aplicada a las muestras: Oasis HLB y MCX. El primero ha resultado más genérico, perdiéndose únicamente el fármaco Gabapentina en dicho proceso de preconcentración. Para la validación cualitativa, se fortifican 3 muestras independientes de cada tipo de agua analizada a dos niveles de concentración (0.1 y 1 µg/L) y se comprueba la capacidad del método para detectar (típicamente, usando la molécula protonada) e identificar (mediante al menos dos iones: molécula protonada y un fragmento) los contaminantes seleccionados como modelo: 146 compuestos entre los que se incluyen 52 pesticidas, 52 medicamentos (21 antibióticos), 13 drogas de abuso, 11 hormonas, 11 micotoxinas y 7 agentes de protección UV. El método desarrollado permite la detección de la gran mayoría de los compuestos ensayados y la identificación de un buen número de ellos. Posteriormente, se ha aplicado dicha metodología al análisis de muestras reales, identificando varios de los contaminantes seleccionados, incluso a niveles de concentración inferiores al más bajo validado. También ha sido posible la detección e identificación tentativa de varios contaminantes no incluidos en la validación del método, incluso sin patrón de referencia disponible, gracias a la valiosa información suministrada por el analizador QTOF-MS. En el segundo bloque se aprovechan las ventajas que ofrece el acoplamiento LC-MS, y en especial HRMS, para aplicaciones metabolómicas que requieren de una elevada sensibilidad instrumental. Este es el caso de los condensados de exhalados pulmonares, cuyas concentraciones de metabolitos son extremadamente bajas y, por tanto, requieren de técnicas más sensibles como son las LC-HRMS frente al típico análisis mediante NMR. En el trabajo realizado, en colaboración con el Instituto de Estudios Biofuncionales de la Universidad Complutense de Madrid (UCM, Madrid, Spain) y llevado a cabo en el Department of Biomolecular Medicine en Imperial College London (London, UK), se realiza un estudio preliminar sobre las capacidades de LC-HRMS y NMR para abordar la diferenciación de pacientes sanos de aquellos con enfermedades respiratorias, concretamente con obstrucción pulmonar crónica, mediante el análisis no invasivo de condensados de exhalados pulmonares. En base a los resultados obtenidos, se propone el uso de LC-HRMS como aproximación metabolómica estándar para este tipo de análisis. En el tercer y último bloque se investigan los marcadores que permiten la diferenciación de alimentos según su origen, especialmente en productos de interés para la Comunidad Valenciana y cuya calidad está directamente relacionada con su D.O. El primero de los trabajos incluidos en este capítulo se centra en el análisis de las diferencias a nivel químico presentes en naranjas de diferentes orígenes. Para ello, se han seleccionado muestras de la Comunidad Valenciana y de países del hemisferio sur (Sudáfrica y Argentina) de variedades de maduración tardía. Las muestras completas (piel y pulpa) se trituran, homogenizan y extraen con una mezcla agua:metanol, se diluyen con agua y finalmente se analizan mediante UHPLC-HRMS. Posteriormente, se procesan los datos mediante análisis multivariante para encontrar los que permitirían la distinción en función del origen. Finalmente, se ha ampliado el muestreo a la siguiente campaña, incluyendo también muestras de Brasil, con la finalidad de comprobar la validez de los marcadores encontrados y su posible aplicación a otros destinos. Se ha encontrado un marcador idóneo en ambos casos (primer y segundo muestreo) que corresponde a un compuesto de tiempo de retención 4.83 minutos, que finalmente y gracias a la información espectral en masa exacta ofrecida por LC-HRMS se ha identificado como Citrusin D. Finalmente, en el último trabajo presentado se ha realizado un estudio similar al de las naranjas. El vino es un producto muy preciado cuyo valor está extremadamente ligado a su origen, entre otros. En este artículo científico se realiza un comparación interlaboratorio para el estudio metabolómico de muestras de vino procedentes de tres importantes denominaciones de origen en España (Ribera del Duero, Rioja y Penedés). Los resultados de ambas plataformas ofrecen una clasificación óptima de las muestras en base a marcadores definidos en las rutas metabólicas de la vitis vinífera. Además, se discute sobre las ventajas y desventajas de ambas plataformas, no solo en el aspecto instrumental (TOF vs Orbitrap) sino también en el procesamiento de los datos y la selección de los marcadores. Como cabía esperar por ser geográficamente la más diversa, la denomiancion de origen Penedés era separada de las otras dos mediante un simple análisis no-supervisado PCA. Para separar completamente las 3 D.O. se analizaron mediante PLS-DA obteniéndose una clasificación correcta para todas las muestras. Se encontraron diversos marcadores de la familia de los polifenoles como la Catequina, Epicatequina y Galactocatequina, entre otros. Finalmente, los marcadores de cada plataforma fueron cuantificados en un modo target en la otra plataforma. Se demostró que, para ambas plataformas, los diferentes marcadores eran significativos y que por tanto, el tratamiento de datos había filtrado estos marcadores. El modelo estadístico aplicado haciendo uso exclusivamente de los marcadores fue capaz de separar perfectamente las diferentes denominaciones de origen mediante PCA.