Oxidoreductive bioprocess intensification through reaction engineering and enzyme immobilization

Abstract

La investigació plasmada en aquesta tesi doctoral tracta l’aplicació dels principis d’enginyeria de reacció i immobilització enzimàtica per a la millora de reaccions d’oxidoreducció biocatalitzades. En una primera part de la tesi, es va estudiar la co-immobilització de la monooxigenasa P450 BM3 juntament amb un enzim regenerador del cofactor NADPH, la glucosa deshidrogenasa (GDH-Tac). Els millors derivats es van obtenir utilitzant dos suports d’agarosa, un funcionalitzat amb grups epoxy (83% i 20% activitats retingudes respectivament) i l’altre amb grups amino (28% i 25% activitats retingudes respectivament). Posteriorment es va provar de re-utilitzar aquests enzims immobilitzats en diferents cicles de reacció utilitzant un dels substrats naturals de la P450 BM3, el laurat de sodi. Un cop demostrat que ambdós enzims immobilitzats podien ser reciclats, es va estudiar l’aplicació d’aquests en dues reaccions d’interès industrial, la hidroxilació de la α-isoforona i la hidroxilació del diclofenac. En el primer cas, va fer falta optimitzar certs paràmetres de la reacció abans d’aplicar els derivats. Un cop es van tenir unes condicions acceptables, es va comprovar que els resultats obtinguts anteriorment amb el laurat de sodi, no podien ser extrapolats. La reutilització no va ser possible. En quant al diclofenac, es van obtenir resultats similars. En ambdós casos però, l’aplicació dels enzims en la seva forma soluble, va permetre obtenir conversions altes: 86.2% per a la α-isoforona (50 mM inicial) i 100% per al diclofenac (3.5 mM inicial). El producte hidroxilat de l’α-isoforona, la 4-hidroxi-isoforona, ha de ser oxidat en un segon pas per arribar a l’intermediari desitjat, la keto-isoforona. Aquesta segona reacció es duu a terme amb una alcohol deshidrogenasa, la qual també necessita un regenerador de cofactor, la NADPH oxidasa. Al aplicar els dos enzims en la seva forma soluble, al cap de 24h, es va aconseguir un 95.7% de rendiment i una productivitat de 6.52 g L-1 dia-1. A part, l’enzim diana, l’alcohol deshidrogenasa, es va poder immobilitzar en epoxy-agarosa obtenint una activitat retinguda del 58.2%. Al intentar re-utilitzar-lo, es va poder operar durant 96h (4 cicles) millorant el rendiment del biocatalitzador fins a 2.5 vegades comparat amb la reacció en soluble. La reacció d’hidrogenació de la α-isoforona, per altre banda, resulta en la 3,3,5- trimetilciclohexanona, un substrat amb interès industrial per a l’obtenció de polímers. En aquest cas, es va utilitzar la Baeyer-Villiger ciclohexanona monooxigenasa juntament amb una glucosa deshidrogenasa comercial (GDH-01) per a realitzar la reacció d’inserció d’un àtom d’oxigen en l’anell de carbonis. Es van optimitzar diferents paràmetres de la reacció com la formulació del biocatalitzador, la velocitat d’adició de substrat i la quantitat d’enzim afegida. Un cop optimitzada la reacció es va escalar primer a 1 litre i finalment a 100 litres. En aquesta última reacció a escala pre-industrial, es va obtenir una conversió del 85%, una productivitat de 2.7 g L- 1 h-1 i un rendiment del biocatalitzador de 0.83 g g-1 cww. Finalment aquesta mateixa reacció es va realitzar utilitzant els enzims immobilitzats i reciclantos. Tant la ciclohexanona monooxigenasa com la glucosa deshidrogenasa (GDH-01) es van poder immobilitzar en agarosa funcionalitzada amb grups amino. En el primer cas es va obtenir una activitat retinguda del 62.4% (mètode obtingut de la bibliografia) i en el segon cas del 62.6%. En reacció, els dos enzims immobilitzats van ser utilitzats tant per separat com conjuntament. Al cap de sis cicles de reacció (132.5 mM de substrat inicial), es va assolir un rendiment de biocatalitzador 3.6 vegades superior per a la monooxigenasa i 1.9 vegades superior per a la GDH- 01 comparat amb la reacció en soluble.

The research performed and disclosed in this thesis deals with the reaction engineering and the enzyme immobilization principles as tools to improve biocatalyzed oxidoreductive reactions. On a first stage, the co-immobilization of the P450 BM3 monooxygenase together with a NADPH cofactor regeneration enzyme, the glucose dehydrogenase (GDH-Tac), was studied. The best derivates were obtained when using two agarose supports, an epoxy functionalized (83% and 20% retained activity respectively) and an amino functionalized (28% and 25% retained activity respectively). Later on, the re-cycling of the immobilized enzymes was tested in reaction cycles using one of the natural substrates of the P450 BM3, the sodium laurate. Once it could be demonstrated that re-cycling of both P450 BM3 and GDH-Tac was possible, both enzymes were studied in two of the project’s target reactions, the hydroxylation of α- isophorone and the hydroxylation of diclofenac. In the first case, the optimization of the reaction conditions had to be performed prior to the reaction cycles. The reactor configuration, the oxygen income or the glucose concentration were adjusted. However, when the reaction was performed using the co-immobilized enzymes, the P450 BM3 was deactivated and it could not be re-used. The same happened with the hydroxylation of diclofenac. On the other hand, the reaction using soluble enzymes, resulted in 86.2% conversion for the α-isophorone (50 mM initial concentration) and 100% for the diclofenac (3.5 mM initial concentration). The product resulting from the hydroxylation of α-isophorone, the 4-hydroxy-isophorone, can be further oxidized to keto-isophorone, an intermediary for the synthesis of carotenoids and vitamin E. In order to enzymatically perform this step, an alcohol dehydrogenase and a NADPH oxidase, as a cofactor regenerator, were employed. When used in their soluble form, after 24 hours, 95.7% yield and a space time yield of 6.52 g L-1 day-1 were achieved. Moreover, the alcohol dehydrogenase was immobilized on epoxy-agarose and 58.2% retained activity was obtained. When re-used, the derivate could operate for 96h (4 cycles) improving the biocatalyst yield 2.5- fold compared with the reaction with soluble enzymes. The hydrogenation of α-isophorone results in 3,3,5-trimethylcyclohexanone, an industrial interesting substrate due to the polymers that can be obtained from its oxidized product, the trimethyl-ε-caprolactone. This compound is obtained by the Baeyer-Villiger insertion of an oxygen atom into the carbon ring. For this purpose, a cyclohexanone monooxygenase together with a commercial glucose dehydrogenase (GDH-01) were used. Different parameters of the reaction were optimized such as the biocatalyst formulation, the substrate addition rate or the biocatalyst loading. Afterwards, the reaction was scaled up to 1 liter first and then up to 100 liters. In this last pre-industrial reaction, 85% conversion, a space time yield of 2.7 g L-1 h-1 and a biocatalyst yield of 0.83 g g-1 cww could be obtained. Finally, this same reaction was performed using both enzymes immobilized and re-cycling was intended. The cyclohexanone monooxygenase could be immobilized following a previously described method and 62.4% retained activity was achieved. In the GDH-01 case, different supports were screened albeit at the end, it was also the amino functionalized agarose that resulted successful. A retained activity of 62.6% was obtained. In the reaction cycles, the immobilized enzymes were used either separately or both together. In the best case scenario, after six cycles of reaction (132.5 mM initial substrate) 3.6-fold and 1.9-fold higher biocatalysts yields were obtained for the monooxygenase and the GDH-01, respectively.