Quatsomes as a novel nanocarrier for clinical delivery of small RNA

Abstract

Les teràpies actuals estan dirigides a modificar la funcionalitat de les proteïnes, les quals només representen el 2% del genoma humà transcrit. No obstant, la possibilitat de dirigir-les a actuar sobre tot el transcriptoma, aproximadament un 70% del genoma, mitjançant l’aplicació de teràpies basades en ARN pot augmentar significativament el nombre de dianes terapèutiques. Els microARN (miARN), petits ARNs endògens no codificadants, podrien ser utilitzats per atacar el transcriptoma interferint en la traducció i l'estabilitat del ARNm diana. No obstant, les teràpies basades en miARN encara estan lluny de la seva aplicació clínica degut, en part, a que presenten una biodistribució subòptima i a una vida mitja curta en el torrent sanguini. El camp de la nanomedicina promet millorar el lliurament precís d’àcids nucleics als tumors diana reduïnt-ne els efectes adversos. Per tant, la conjugació dels miARN amb nanopartícules podria ser una bona estratègia per obtenir els efectes antitumorals dels miRNAs in vivo. No obstant, encara és necessari el descobriment d’una formulació de referència capaç d’aministrar miARN a la clínica. En aquesta tesi, el miR-323a-5p, el qual té propietats supressores de tumors, es va seleccionar com a prova de concepte de les teràpies basades en miARN per tal de tractar el neuroblastoma (NB) d’alt risc. Per implementar-ho a la clínica, en aquesta tesi s’han dissenyat i sintetitzat unes nanopartícules basades en una nova formulació clínicament administrable anomenada Quatsomes (QS), capaç de transportar petits ARN per al tractament del càncer. Els QS són nanovesícules lípidiques no liposomals preparades mitjançant la tecnologia DELOS-SUSP. En comparació a altres nanopartícules, com els liposomes, els QS són petites nanovesícules unilamel·lars amb una alta homogeneïtat i càrrega positiva, la qual que els atorga una excel·lent estabilitat col·loïdal a llarg termini i la capacitat de conjugar-se de forma eficient amb petits ARNs en la seva superfície. Concretament, les noves formulacions de QS dissenyades s’han optimitzat per millorar la seva capacitat de complexació de petits ARN potencialment terapèutics (com ara el miR-323a-5p i el siCCND1), els quals s’ha observat que poden frenar la progressió de les cèl·lules canceroses de neuroblastoma. Els conjugats de QS i miARN van demostrar una eficient complexació del petit ARN, resistència a les nucleases, una elevada eficiència de transfecció i la posterior acumulació del miARN madur a nivell intracel·lular. Des del punt de vista funcional, el tractament de les cèl·lules de NB amb els nanoconjugats QS-miR-323a-5p va induir la modificació dels gens diana del miR-323a-5p, com són CCND1 o CHAF1A, a nivell de ARNm i proteïnes i van induir una reducció de la viabilitat de les cèl·lules tumorals. En conclusió, els resultats aconseguits en aquesta tesi donen suport a l’aplicació dels nanoconjugats basats en QS i petits ARN com a eina potencial per al tractament de malalties humanes.

Current medicines are directed to modify the functionality of proteins, which represent only 2% of human transcribed genome. However, the possibility of targeting the transcriptome, i.e. ~ 70% of the genome, using RNA-based therapies will expand significantly the number of druggable targets. MicroRNA (miRNA), endogenous small non-coding RNAs, could be used to target the transcriptome interfering in the translation and stability of target mRNA genes. Nevertheless, miRNA-based therapies have not reached the market due, in part, to suboptimal biodistribution and short half-life in bloodstream. Nanomedicine promises the precise delivery of nucleic acids into tumours with reduced off-target toxicities. Hence, conjugation of miRNA to nanoparticles could be a good strategy to test anti-tumour effects of miRNAs in vivo. However, there is still a lack of a standard formulation for their clinical administration. In this thesis, the tumour suppressive miR-323a-5p was selected as a proof of concept for miRNA-based therapies to treat high-risk neuroblastoma (NB) tumours. To move forward this discovery to clinical applications and to overcome the current challenges for delivering small RNA for cancer treatment, we have designed and synthetized a clinical formulation based on novel nanoparticles, called Quatsomes (QS). QS are non-liposomal lipid nanovesicles prepared using the DELOS-SUSP technology. Compared to other nanoparticles, such as liposomes, QS are small unilamellar vesicles with high homogeneity and positive charge, which grants an excellent long-term colloidal stability and the efficient entrapment of small RNA (sRNA) in their surface. New QS-based formulations were designed to optimize the complexation of potentially-therapeutic small RNA (i.e. miR-323a-5p and siCCND1) which can halt the progression of cancer cells. QS-miR-323a-5p and QS-siCCND1 complexes showed efficient miRNA complexation, enhanced resistance to nucleases, high transfection efficiency and intracellular accumulation of mature miRNA forms. From the functional point of view, treatment of NB cells with miR-323a-5p nanoconjugates induced downregulation of bona fide miR-323a-5p targets, such as CCND1 or CHAF1A, at mRNA and protein level and induced a reduction in tumour cell viability. In summary, the results achieved in this thesis support the application of QS-sRNA nanoconjugates as a potential tool for the treatment of human disease.