Aplicació de les noves tecnologies de seqüenciació massiva en la millora de la caracterització de la sang de cordó umbilical: gens HLA i polimorfisme CCR5-Δ32

Abstract

La sang de cordó umbilical és una font de cèl·lules mare pel trasplantament hematopoètic. Tot i el menor grau de compatibilitat HLA que s’ha acceptat, històricament, per aquest tipus de trasplantament, s’ha demostrat que tenir en compte els gens HLA-A, -B, -C i -DRB1 en alta resolució s’associa amb millors resultats de trasplantament. Actualment, es recomana aquest grau de compatibilitat, així com considerar els antígens HLA materns no heretats o NIMA, quan existeix una incompatibilitat entre la unitat de cordó i el receptor. D’altra banda, també s’ha proposat utilitzar unitats homozigotes pel polimorfisme CCR5-∆32, el qual confereix resistència a la infecció del HIV, per aquells pacients HIV+ que requereixin un trasplantament. Per tot això, l’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral ha estat millorar la caracterització de les unitats de més bona qualitat cel·lular del programa Concordia, mitjançant la determinació del polimorfisme CCR5-∆32 i la tipificació dels gens HLA. La caracterització del gen CCR5 en més de 8.000 unitats del banc, ha permès determinar 54 unitats homozigotes pel polimorfisme CCR5-∆32, les quals formen part d’un inventari de 130 unitats homozigotes identificades al registre espanyol. Altrament, s’ha desenvolupat i validat satisfactòriament una estratègia de tipificació HLA de molt baix cost basada en la seqüenciació de nova generació, que permet la tipificació en alta resolució dels gens HLA-A, -B, -C i -DRB1, així com la caracterització simultània del polimorfisme CCR5-∆32. Aquesta estratègia s’ha implementat en la tipificació de més de 5.000 unitats de cordó del banc i 2.500 mostres maternes associades. Això ha permès realitzar el primer estudi de freqüències HLA del banc de cordó de Barcelona i el més extens realitzat fins al dia d’avui en la població espanyola. Finalment, s’ha analitzat l’impacte de l’alta resolució de les unitats de cordó i la tipificació HLA materna en la seva selecció preferent pel trasplantament. Per aquesta finalitat, s’ha realitzat un seguiment, de fins a 17 mesos, de tres grups d’estudi formats per 2.012 unitats cadascun. Les unitats del primer grup, així com les seves respectives mostres maternes, presenten una tipificació en alta resolució en HLA-A, -B, -C i -DRB1. Les unitats del segon grup també presenten una tipificació HLA en alta resolució, però no tipificació materna, mentre que les unitats del darrer grup es troben tipificades d’acord amb els criteris de selecció convencionals: baixa resolució en HLA-A i -B i alta resolució en HLA-DRB1. Tot i que s’ha observat una major tendència a seleccionar les unitats amb tipificació HLA en alta resolució i tipificació materna, no s’ha pogut demostrar un impacte significatiu de les variables estudiades en la selecció preferent de les unitats. Els resultats d’aquest estudi, probablement influenciats per la disminució del trasplantament de cordó en els últims anys, posen de manifest la necessitat de disposar d’uns criteris de selecció de la sang de cordó ben establerts i reconeguts de manera global, basats en les evidències científiques, així com d’incrementar l’accessibilitat dels clínics a la informació disponible als registres de donants. En conjunt, el desenvolupament d’aquesta tesi doctoral, on les tecnologies de seqüenciació de nova generació hi han tingut un paper cabdal, ha permès millorar la caracterització de l’inventari de cordons del programa Concordia, el que facilita 1) la utilització d’unitats CCR5-∆32 per pacients HIV+ que requereixen un trasplantament hematopoètic, 2) la selecció de les unitats de cordó d’acord amb els criteris de compatibilitat HLA recomanats actualment i 3) la utilització de la compatibilitat NIMA en estudis prospectius. Així també, ha permès disposar d’un estudi de freqüències HLA en alta resolució, representatiu de la cohort de cordons del banc, però també de la població espanyola.

Umbilical cord blood is a rich source of stem cells useful for hematopoietic transplantation. Although this kind of transplantation is historically considered to need a lower level of HLA compatibility, high-resolution matching at HLA-A, -B, -C and -DRB1 genes has been associated to better transplantation outcomes. Nowadays, it is recommended to reach this level of compatibility as well as take into consideration the non-inherited maternal antigens or NIMA if a mismatch between the recipient and the cord blood unit exists. Otherwise, the use of cord blood units homozygous for CCR5-∆32 polymorphism has been recommended for HIV+ patients undergoing a hematopoietic transplantation, in order to confer resistance to the viral infection. For all these reasons, the main objective of the present thesis pursued to improve the characterization of the cord blood units with highest cellular quality in Concordia programme by CCR5-∆32 polymorphism and HLA genes typing. CCR5 gene was characterized in more than 8,000 cord blood units, 54 of which were homozygous for CCR5-∆32 polymorphism and became part of the 130 homozygous units in the Spanish registries. In addition, a low-cost strategy based on next generation sequencing technology for simultaneous HLA (-A, -B, -C and -DRB1) and CCR5-∆32 polymorphism determination was developed and successfully validated. This novel strategy was used for the characterization of more than 5,000 cord blood units and 2,500 associated maternal samples, which supposed the first analysis of HLA frequencies in the Cord Blood bank of Barcelona and the largest one performed so far in the Spanish population. Moreover, this thesis assessed the impact of high-resolution and maternal HLA determination on the odds of cord blood units to be selected for hematopoietic transplantation. To this end, three study groups composed by 2,012 cord blood units each were monitored for up to 17 months. The units and associated maternal samples of the first group had a high-resolution determination of HLA-A, -B, -C and -DRB1. In the second group, units presented high-resolution determination of HLA genes but lacked maternal HLA information, while the units in third group were characterized following conventional criteria: low-resolution sequencing for HLA-A and -B and high-resolution sequencing for HLA-DRB1. Despite a trend toward a greater selection of units with high-resolution and maternal typing, we failed to demonstrate a significant impact of the analysed variables on the eligibility of these units. The results from this study were probably influenced by the decrease in the number cord blood transplantations during last years. Nevertheless, these results highlight the strong need for well-established, evidence-based and globally accepted criteria for the selection of umbilical cord blood, as well as the necessity to improve the accessibility of clinicians to the information available in the donor public registries. Altogether, with the help of next generation sequencing techniques, the present thesis contributed to improve the characterization of the CBU inventory in Concordia programme, by facilitating 1) the use of cord blood units containing CCR5-∆32 polymorphism for HIV+ patients undergoing a hematopoietic transplantation, 2) the selection of cord blood units based on the currently recommended HLA histocompatibility criteria, and 3) the use of NIMA histocompatibility in prospective studies. In addition, this thesis includes the first study of HLA frequencies determined by high-resolution sequencing, large enough to be representative of the Spanish population.