Improved synthesis routes and coating approaches of anisotropic magnetite nanoparticles for theranostics

Abstract

Esta tesis aborda la síntesis, caracterización y funcionalización de nanoestructuras magnéticas biocompatibles y anisótropas de óxido de hierro (Fe3O4) para su aplicación en diagnóstico biomédico mediante imagen de resonancia magnética (MRI) y uso terapéutico en dos modalidades de hipertermia: magnética y fototérmica. Para ello, se escogieron dos tipos de estructuras: nanocubos y nanorods. Para sintetizar los nanocubos, se probaron varios métodos ya publicados. Sin embargo, ninguno de ellos proporcionó resultados completamente satisfactorios en cuanto a monodispersión de tamaños, reproducibilidad, pureza de fase, alta cristalinidad y definición de forma. Por ello, desarrollamos una estrategia nueva basada en la introducción de oleato de sodio y una mezcla de disolventes que permitían el control de la temperatura de reflujo y la polaridad del medio, lo que además mejoró la estabilidad química del entorno en el que tenía lugar el crecimiento, dando lugar a una síntesis más reproducible. Estos resultados mostraron el éxito a la hora de producir partículas cúbicas en un rango de tamaños muy amplio, con unas excelentes propiedades y reproducibilidad. En cuanto a los nanorods, la síntesis fue especialmente complicada, ya que la estructura cúbica del Fe3O4 dificulta la formación de morfologías tan alargadas. De entre todos los procedimientos probados, solo la síntesis solvotermal dio buenos resultados. Para tener un mejor control sobre el tamaño y la relación de aspecto, se desarrollaron nuevas estrategias basadas en el ajuste de la presión y del ratio entre surfactantes. La superficie de las partículas sintetizadas es hidrófoba y por tanto fue necesario modificarla para que éstas pudieran dispersarse en medios biológicos. Además, el recubrimiento de las partículas debería proporcionar grupos funcionales para conjugar biomoléculas y así dirigirlas contra células malignas. Se probaron varias estrategias y los resultados mostraron que, a pesar de que la repulsión electrostática puede ser suficiente para estabilizar nanopartículas pequeñas o no magnéticas, en nuestro caso era necesario combinarla con impedimento estérico para evitar la agregación irreversible. Con este fin, se desarrolló un nuevo procedimiento de encapsulación basado en la formación de bicapas lipídicas que, a pesar de dar resultados prometedores, fue descartado finalmente al tener en cuenta el tiempo que se necesitaría para optimizar completamente todo el protocolo. En su lugar, se usó un procedimiento basado en la encapsulación con copolímeros anfipáticos, que también dio unos resultados excelentes, garantizando la estabilidad coloidal en entornos biológicos. El potencial biomédico de las partículas se evaluó primero como herramienta diagnóstica midiendo el contraste T2 para resonancia magnética de partículas de diferentes tamaños y formas, resaltando el mayor contraste de las nanopartículas anisótropas respecto a las isótropas (esferas). En cuanto al uso terapéutico, se evaluó también el potencial de las partículas en hipertermia magnética. Los resultados mostraron una buena capacidad de calentamiento a pesar de las suaves condiciones que usamos en nuestro estudio. Además, gracias a un amplio estudio espectroscópico teórico y experimental, se vio que las nanopartículas de Fe3O4 son adecuadas para fototermia, sobre todo en la segunda ventana biológica del infrarrojo cercano (1000-1350 nm). Esta región espectral es especialmente interesante porque permite la aplicación de mayores potencias de irradiación y tiene una mayor penetración en los tejidos humanos. A 1064 nm se consiguieron eficiencias de calentamiento óptico similares a los mejores agentes fototérmicos. Además, se aprovecharon las anisotropías magnética y óptica para medir la temperatura local en tiempo real mediante un método relativamente nuevo. Los experimentos in vitro usando células tumorales HeLa demostraron que las nanopartículas son internalizadas fácilmente y que no son tóxicas para concentraciones inferiores a 4 mM de hierro y que la fototermia usando nanocubos de Fe3O4 es una terapia excelente para destruir células tumorales.

This thesis tackles the synthesis, characterisation and functionalisation of biocompatible anisotropic iron oxide (Fe3O4) magnetic nanostructures for their application in biomedical diagnosis by means of magnetic resonance imaging (MRI) and therapy by two different modalities of hyperthermal therapy: magnetic fluid hyperthermia and photothermia. Two different types of structures were chosen for these purposes: nanocubes and nanorods. Several approaches published in literature were tested to synthesize the nanocubes. However, none of them rendered fully satisfactory results in size monodispersity, reproducibility, phase purity, high crystallinity and well-defined shape. Thus, we developed a new strategy based on the introduction of sodium oleate and a solvent mixture enabling the control of the reflux temperature and the polarity of the medium, which also resulted in an improvement of the chemical stability of the growth environment, leading to a more reproducible synthesis. The results demonstrate the successful synthesis of highly cubic particles in a very broad size range, with excellent properties and reproducibility. Concerning the nanorods, their synthesis was particularly challenging since the cubic crystal structure of Fe3O4 complicates the formation of such elongated morphologies. Among all the tested procedures, only the solvothermal synthesis provided good results. To have a better control on the size and aspect ratio new approaches based on adjusting the pressure and surfactants have been developed. The surface of the freshly synthesized particles is hydrophobic and therefore it was necessary to modify the surface to make them dispersible in biological media. In addition, the coating should provide functional groups to attach biomolecules for targeting malignant cells. Several approaches were tested and the results showed that, despite electrostatic repulsion can be enough to stabilize smaller or non-magnetic nanoparticles, in our case it was necessary to combine it also with steric hindrance to avoid irreversible aggregation. For this purpose, a novel procedure based on the formation of a lipid bilayer coating was developed which, despite providing promising results, was eventually discarded considering the time that would be required to fully optimise the protocol. Instead, a procedure based on the coating with amphiphilic copolymers was used, which also provided excellent results, ensuring colloidal stability in biological environments. The biomedical potential of the particles was evaluated first as a diagnostic tool by measuring the MRI T2 contrast of particles of different sizes and shapes, evidencing the enhanced contrast of anisotropic nanoparticles with respect to isotropic ones (spheres). In terms of therapy, the potential of the particles in terms of magnetic hyperthermia was also evaluated. The results showed the good heating capacity of the particles despite the mild conditions used in our study. In addition, thanks to a comprehensive theoretical and experimental spectroscopic study, it was established that Fe3O4 nanoparticles are suitable for photothermia, particularly in the near infrared second biological window (1000-1350 nm). This spectral range is especially appealing because it allows the application of higher powers and has a deeper penetration in human tissues. At 1064 nm were measured some heating efficiencies similar to the best photothermal agents. In addition, the magnetic and optic anisotropies were exploited for a relatively new approach for in situ local temperature sensing. The in vitro experiments using HeLa cancerous cells demonstrated that the nanoparticles are easily internalized and are not toxic for concentrations below 4 mM Fe and that photothermia using Fe3O4 nanocubes at 1064 nm is an excellent therapy for destroying cancerous cells.