Gut commensal microbiota and intestinal inflammation: modulatory role of rifaximin

Abstract

Els trastorns funcionals gastrointestinals (síndrome de l'intestí irritable) i la malaltia inflamatòria intestinal presenten una inflamació crònica del tracte gastrointestinal. Encara que la seva patogènia no es coneix totalment, totes dues malalties resulten de la interacció de la microbiota amb factors ambientals que convergeixen en individus genèticament susceptibles, donant lloc a una activació anòmala del sistema immune. Els antibiòtics amb activitat immunomoduladora són una opció terapèutica interessant per la seva acció simultània davant la microbiota i la reacció immunitària. La rifaximina és un antibiòtic no absorbible aprovat pel tractament de la síndrome de l'intestí irritable amb diarrea i amb efectes beneficiosos en la malaltia inflamatòria intestinal. No obstant, es desconeix el seu mecanisme d'acció i la contribució dels seus efectes antimicrobians i immunomoduladors.

Aquest treball explora el mecanisme d'acció de la rifaximina en ratolins sans i durant la inflamació intestinal aguda. Es valoraren els efectes de la rifaximina en animals sans i en animals amb colitis aguda, utilitzant el model de colitis induïda per dextrà sulfat sòdic (DSS, 3% en aigua, 5 dies). Els ratolins es tractaren preventivament amb rifaximina o doxiciclina (control positiu). Es valoraren els signes clínics d'inflamació del còlon (macroscòpicament i histopatologia) en la necròpsia. La microbiota ceco-còlica, luminal i adherida a l'epiteli, es caracteritzarà mitjançant: hibridació in situ fluorescent (FISH), polimorfismes de longitud de fragments de restricció (T-RFLP) i seqüenciació del 16S ARNr. La resposta immune local i els mecanismes de interacció hoste-microbiota es valoraren determinant canvis en l'expressió gènica (RT-qPCR) de citocines pro- i antiinflamatòries, pèptids antimicrobians i receptors de tipus Toll (TLRs).

En animals sans, la rifaximina no va modificar els recomptes totals, la biodiversitat o la adherència a la paret del còlon dels bacteris ceco-còlics. Només es van observar canvis menors en l'expressió de TLRs o d'altres marcadors de tipus immune. Els animals que van rebre DSS van mostrar signes clínics indicatius del desenvolupament de colitis, amb regulació a l'alça en l'expressió de marcadors immunes, incloent el pèptid antimicrobià RegIIIɣ. La rifaximina no va afectar el curs clínic de la colitis ni l'expressió d'aquests marcadors. Per contra, la doxiciclina va atenuar les dues respostes. Independentment del tractament aplicat, només es van observar canvis menors en l'expressió de TLRs. L'expressió del receptor X de pregnà (PXR) va disminuir durant la inducció de la colitis, un canvi no modificat per la rifaximina, però que es va prevenir amb la doxiciclina. La colitis va induir una disbiosi caracteritzada per un augment de Verrucomicrobia i Deferribacteres amb un descens de Bacteroidetes, mantenint-se la diversitat de tipus alfa. Durant el tractament amb rifaximina, amb o sense colitis, es va mantenir la biodiversitat, amb una composició bacteriana molt similar a l'observada en animals sans. Els animals tractats amb doxiciclina van mostrar canvis extensos en la microbiota, amb similituds entre els grups inflamat i no inflamat. Concretament, la doxiciclina va reduir els grups Clostridiales patogènics, mentre que va augmentar els Clostridia grup XIVa, Lactobacillus i Ruminococcus, considerats grups beneficiosos.

Aquests resultats mostren que en animals sans la rifaximina presenta una activitat antimicrobiana i immunomoduladora limitada. En estat de colitis, la rifaximina no manifesta efectes immunomoduladors ni antimicrobians consistents amb una activitat antiinflamatòria. No obstant això, aquestes accions no es poden excloure en humans, explicant els efectes beneficiosos observats clínicament. Tenint en compte que en humans la rifaximina actuaria a través dels PXR, és possible que el model de colitis induïda per DSS en ratolí no sigui l'adequat per estudiar el seu mecanisme d'acció. (...)

Los trastornos funcionales gastrointestinales (síndrome del intestino irritable) y la enfermedad inflamatoria intestinal presentan una inflamación crónica del tracto gastrointestinal. Aunque su patogenia no se conoce totalmente, ambas enfermedades resultan de la interacción de la microbiota con factores ambientales que convergen en individuos genéticamente susceptibles, dando lugar a una activación anómala del sistema inmune. Los antibióticos con actividad inmunomoduladora son una opción terapéutica interesante por su acción simultánea frente la microbiota y la reacción inmunitaria. La rifaximina es un antibiótico no absorbible aprobado para el tratamiento del síndrome del intestino irritable con diarrea y con efectos beneficiosos en la enfermedad inflamatoria intestinal. Sin embargo, se desconoce su mecanismo de acción y la contribución de sus efectos antimicrobianos e inmunomoduladores.

Este trabajo explora el mecanismo de acción de la rifaximina en ratones sanos y durante la inflamación intestinal aguda. Se valoraron los efectos de la rifaximina en animales sanos y en animales con colitis aguda, utilizando el modelo de colitis inducida por dextrano sulfato sódico (DSS, 3% en agua, 5 días). Los ratones se trataron preventivamente con rifaximina o doxiciclina (control positivo). Se valoraron los signos clínicos de inflamación y el estado del colon (macroscópicamente e histopatología) en el momento de la necropsia. La microbiota ceco-cólica, luminal y adherida al epitelio, se caracterizó mediante: hibridación in situ fluorescente (FISH), polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (T-RFLP) y secuenciación del 16S ARNr. La respuesta inmune local y los mecanismos de interacción hospedador-microbiota se valoraron determinando cambios en la expresión génica (RT-qPCR) de citoquinas pro- y anti-inflamatorias, péptidos antimicrobianos y receptores de tipo Toll (TLRs).

En animales sanos, la rifaximina no modificó los recuentos totales de bacterias ceco-cólicas, su biodiversidad o la adherencia bacteriana a la pared del colon. Sólo se observaron cambios menores en la expresión de TLRs o de otros marcadores de tipo inmune. Los animales que recibieron DSS mostraron signos clínicos indicativos del desarrollo de colitis, con regulación al alza en la expresión de marcadores inmunes, incluyendo al péptido antimicrobiano RegIIIɣ. La rifaximina no afectó el curso clínico de la colitis ni la expresión de dichos marcadores. Por el contrario, la doxiciclina atenuó ambas respuestas. Con independencia del tratamiento aplicado, sólo se observaron cambios menores en la expresión de TLRs. La expresión del receptor X de pregnano (PXR) disminuyó durante la inducción de la colitis, un cambio no modificado por la rifaximina, pero que se previno con la doxiciclina. La colitis indujo una disbiosis caracterizada por un aumento de Verrucomicrobia y Deferribacteres con un descenso de Bacteroidetes, manteniéndose la diversidad de tipo alfa. Durante el tratamiento con rifaximina, con o sin colitis, se mantuvo la biodiversidad, con una composición bacteriana muy similar a la observada en animales sanos. Los animales tratados con doxiciclina mostraron cambios extensos en la microbiota, con similitudes entre los grupos inflamado y no inflamado. Concretamente, la doxiciclina redujo los grupos Clostridiales patogénicos, mientras que aumentó los Clostridia grupo XIVa, Lactobacillus and Ruminococcus, considerados grupos beneficiosos.

Estos resultados muestran que en animales sanos la rifaximina presenta una actividad antimicrobiana e inmunomoduladora limitada. En estado de colitis, la rifaximina no manifiesta efectos inmunomoduladores ni antimicrobianos consistentes con una actividad anti-inflamatoria. Sin embargo, estas acciones no pueden excluirse en humanos, explicando los efectos beneficiosos observados clínicamente. (...)

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common component of functional gastrointestinal disorders (irritable bowel syndrome, IBS and inflammatory bowel disease, IBD). Evidences indicate that both arise because of a convergence of altered microbiota and external environmental factors in genetically susceptible individuals, leading to abnormal immune responses and the development of persistent inflammation, through a mechanism not fully understood. Given the important role of the microbiota and the immune system in their pathogenesis, immunomodulatory antibiotics are an interesting therapeutic approach, targeting simultaneously the microbiota and the exacerbated inflammatory response. Rifaximin is a non-absorbable antibiotic approved for the treatment of IBS with diarrhea and with beneficial effects in IBD. However, the mechanisms mediating these effects and the exact contribution of its antimicrobial and immunomodulatory activities are not fully understood.

This work explores the mechanisms of action of rifaximin modulating gut microbiota and the local immune system in a healthy state and during acute intestinal inflammation using a dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis mouse model. First, healthy female mice were treated with either vehicle or rifaximin during 7 or 14 days. In a second study, colitis was induced with DSS (3% in water, 5 days). Mice were treated, in a preventive manner, with either rifaximin or doxycycline, serving as positive control. Daily clinical signs were recorded. At necropsy, colonic inflammation was assessed (macroscopic signs and histopathology). Luminal and wall-adhered ceco-colonic microbiota were characterized by fluorescent in situ hybridization (FISH), terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and 16S rRNA gene sequencing. Local immune responses and host-bacterial interactions were determined assessing the expression (RT-qPCR) of pro- and anti-inflammatory cytokines, antimicrobial peptides and Toll-like receptors (TLRs).

In healthy mice, rifaximin did not modify neither total ceco-colonic bacterial counts not microbial biodiversity. Moreover, rifaximin was associated to a minor upregulation of TLRs expression, without changes in the expression of immune-related markers. Animals receiving DSS showed clinical signs indicative of the development of colitis. Rifaximin did not affect the clinical course of colitis, while doxycycline attenuated clinical signs. Similarly, colitis-associated up-regulation of immune-related markers was not affected by rifaximin, while doxycycline completely prevented this response. As it relates to host-bacterial interaction markers, colitis selectively up-regulated the antimicrobial peptide RegIIIɣ, while it had minor effects on TLRs expression. Rifaximin did not affect colitis-associated RegIIIɣ up-regulation, while doxycycline completely normalized its expression. The pregnane X receptor (PXR) was down-regulated during colitis, a change not affected by rifaximin but prevented by doxycycline. DSS-induced colitis was associated to a dysbiotic state characterized by an increase in Verrucomicrobia and Deferribacteres and a simultaneous decrease in Bacteroidetes; with a maintenance of alpha diversity. During rifaximin treatment, with or without colitis, bacterial richness was maintained, with a bacterial composition closely related to that observed in healthy animals, vs. that observed during colitis. Doxycycline-treated animals showed extensive changes in their microbiota, with similarities between the inflamed and non-inflamed conditions. Particularly, doxycycline reduced pathogenic Clostridiales, while increased Clostridia cluster XIVa-related, Lactobacillus and Ruminococcus, considered beneficial groups. (...)