Papel de la citómica funcional en el estudio de mecanismos de refractariedad de las neoplasias hematológicas

Abstract

La leucèmia aguda i el mieloma múltiple són neoplàsies hematològiques que tenen una incidència notable en la població, causant una elevada mortalitat anualment. Una de les principals causes de la mortalitat és la refractarietat al tractament i la recaiguda. Tot i els avenços terapèutics, la majoria de pacients experimenta recaigudes o refractarietat, fet que fa que aquestes malalties siguin incurables. La citòmica funcional és una disciplina que permet l’anàlisi multiparamètric de l’heterogeneïtat cel·lular i dels citomes, relacionant la genòmica i la proteòmica amb la dinàmica i funció cel·lular. Aquesta tecnologia podria ser clau per a detectar cèl·lules relacionades amb la refractarietat, ja que permet la manipulació mínima dels espècimens a estudi, així com la mimetització de les condicions fisiològiques. Tot això pot contribuir a detectar de manera més eficient aquestes cèl·lules i a permetre el desenvolupament de noves aproximacions per a l’estudi de la malaltia refractària. L’objectiu de la Tesi Doctoral va residir en desenvolupar nous sistemes alternatius per a estudiar i identificar poblacions cel·lulars relacionades amb la refractarietat al tractament, aplicant aproximacions citòmiques avançades que van permetre realitzar estudis a nivell fenotípic i funcional, amb una pertorbació mínima de l’espècimen. En el primer treball es va desenvolupar una tecnologia basada en citòmica funcional per a determinar l’activitat fosfatasa alcalina en subpoblacions de cèl·lules mare de la leucèmia aguda avaluant-se com a mètode potencial per a detectar subpoblacions associades a una major refractarietat al tractament. En els pacients diagnosticats de leucèmia aguda refractaria, es van determinar poblacions CD34+\/ALPhigh en diferents seguiments que podrien estar associades amb la leucemogènesi al llarg del temps. Per a explorar la significança de l’activitat fosfatasa alcalina en el moment del diagnòstic de leucèmia mieloide aguda, es va realitzar un estudi prospectiu en 43 pacients. Es va demostrar que la detecció de l’activitat fosfatasa alcalina es mostrava com a un factor pronòstic independent de supervivència lliure d’esdeveniments, podent ésser inclosa en l’estratificació de risc actual de la malaltia. En el segon treball, mitjançant la utilització de la citòmica funcional, es va tractar de dissenyar i avaluar una nova metodologia per identificar les cèl·lules supressores d’origen mieloide amb expressió de PD-L1 en pacients amb mieloma múltiple, amb l’objectiu de predir l’èxit de la immunoteràpia amb inhibidors PD-L1. La clau de la metodologia desenvolupada va residir en la utilització de cèl·lules vives i en el propòsit de mimetitzar les condicions fisiològiques, per a tractar de comprendre els mecanismes de regulació del lligand. La combinació de la detecció immunofenotípica de PD-L1 amb l’estimulació cel·lular va revelar diferències en la reactivitat de la molècula en els 35 pacients estudiats. Les diferències observades van suggerir una gran plasticitat estèrica de la molècula que podria contribuir a explicar la gran heterogeneïtat en la resposta a la immunoteràpia. En conclusió, gràcies als treballs desenvolupats en la Tesi Doctoral s’han aportat noves evidències de la importància de la citòmica funcional en l’estudi de la neoplàsia, proporcionant abordatges complementaris a les tecnologies actuals en la comprensió de l’evolució de la malaltia.

La leucemia aguda y el mieloma múltiple son neoplasias hematológicas con una incidencia notable en la población y una elevada mortalidad. Una de las principales causas de la mortalidad es la refractariedad al tratamiento y la recaída. A pesar de los grandes avances terapéuticos, la mayoría de pacientes experimenta recaídas o refractariedad, haciendo que estas enfermedades sean incurables. La citómica funcional es una disciplina que permite el análisis multiparamétrico de la heterogeneidad celular y de los citomas, relacionando la genómica y la proteómica con la dinámica y función celular. Esta tecnología podría ser clave para detectar células relacionadas con la refractariedad, permitiendo la manipulación mínima de los especímenes de estudio, así como la mimetización de las condiciones fisiológicas. Todo ello puede contribuir a detectar eficientemente dichas células y a desarrollar nuevas aproximaciones para el estudio de las implicaciones pronósticas y de la predicción de riesgo de recaída o enfermedad refractaria. \r\nEl objetivo de la Tesis Doctoral residió en desarrollar nuevos sistemas alternativos para estudiar e identificar poblaciones celulares refractarias, aplicando aproximaciones citómicas avanzadas que permitían realizar estudios a nivel fenotípico y funcional, con una perturbación mínima del espécimen. En el primer trabajo se desarrolló una tecnología basada en citómica funcional para determinar la actividad fosfatasa alcalina en subpoblaciones de células madre de la leucemia aguda evaluándose como método potencial para detectar subpoblaciones refractarias. En los pacientes diagnosticados de leucemia aguda refractaria, se determinaron poblaciones CD34+\/ALPhigh en distintos seguimientos que podrían estar asociadas con la leucemogénesis a lo largo del tiempo. Para explorar la significancia de la actividad fosfatasa alcalina celular en el momento del diagnóstico de leucemia mieloide aguda, se realizó un estudio prospectivo en 43 pacientes. Se demostró que la detección de la actividad fosfatasa alcalina se mostraba como un factor pronóstico independiente de supervivencia libre de eventos, pudiendo ser incluida en la estratificación de riesgo actual de la enfermedad. En segundo trabajo, mediante la utilización de la citómica funcional, se trató de dise\u00F1ar y evaluar una nueva metodología para identificar las células supresoras de origen mieloide con expresión de PD-L1 en pacientes con mieloma múltiple, con el objetivo predecir el éxito de la inmunoterapia con inhibidores de PD-L1. La clave de la metodología desarrollada residió en la utilización de células vivas y en el propósito de mimetizar las condiciones fisiológicas, para tratar de comprender los mecanismos de regulación del ligando. La combinación de la detección inmunofenotípica de PD-L1 con la estimulación celular reveló diferencias en la reactividad de la molécula en los 35 pacientes estudiados. Las diferencias observadas, sugirieron una gran plasticidad estérica de la molécula que podría contribuir a explicar la gran heterogeneidad en el grado de respuesta a la inmunoterapia. En conclusión, gracias a los trabajos desarrollados en la Tesis Doctoral se han aportado nuevas evidencias de la importancia de la citómica funcional en el estudio de la neoplasia hematológica, proporcionando abordajes complementarios a las tecnologías actuales en la comprensión de la evolución de la enfermedad.

Acute leukemia and multiple myeloma include a group of hematological malignances with a noticeable incidence among the population and causing a high mortality per year. The main causes of this high mortality rate are due to treatment refractoriness and disease relapse. Despite new therapeutic approaches, most patients eventually relapse or show treatment refractoriness and these diseases become still incurables. Functional cytomics is a discipline that allows a multiparametric analysis of the cellular heterogeneity and cytomes, and connects genomics and proteomics with cell dynamics and function. This technology can provide new insights for refractory cells detection due to samples can be minimally manipulated and physiological conditions can be maintained. These characteristics can contribute to a more efficient detection of these cells and to the development of new approaches for prognosis and for the study of relapse or refractoriness risk prediction. The aim and main purpose of the Doctoral Thesis was to develop novel alternative systems to study and to identify cell populations involved in treatment refractoriness in hematological malignances based on advanced cytomic approaches allowing functional and phenotypic studies with a minimal sample perturbation. The first study involved the development of a functional cytomics based technology for a prospective alkaline phosphatase activity determination in acute leukemia stem cells subpopulations and their evaluation as a potential method to detect cell populations associated with a higher treatment refractoriness. CD34+\/ALPhigh cell populations were detected at disease follow up in patients diagnosed with refractory acute leukemia. Our results suggested that CD34+\/ALPhigh cells appeared to sustain leukemogenesis over time. To explore cellular alkaline phosphatase activity significance in acute myeloid leukemia, we performed a prospective study including 43 newly diagnosed patients. Alkaline phosphatase determination at diagnosis appeared to be an independent event-free survival prognostic factor and could be included in current disease risk stratification models. In the second study, we designed and evaluated a novel functional cytomics based methodology to identify myeloid-derived suppressor cells expressing PD-L1 in multiple myeloma patients with the aim to predict immunotherapy targeting PD-1\/PD-L1 checkpoint success. The key point of this methodology was the use of living cells and the maintenance of the physiological conditions. PD-L1 immunophenotyping determination combined with cell stimulation revealed molecular reactivity differences among 35 multiple myeloma patients. Observed differences suggested a great molecular steric plasticity that may contribute to explain heterogeneous immunotherapeutic treatment responses. In conclusion, the studies here developed provide novel evidences about the importance of functional cytomics in the study of hematological malignances. Moreover, these methodologies, in addition to current approaches, may contribute to a better comprehension of disease evolution.