Antimicrobial and immune-modulation action within the RNase A superfamily using macrophage infection models

Abstract

La tesi es va centrar en l'anàlisi de la funció biològica de les RNases humanes, destacant l'acció de regulació immunològica en macròfags per combatre la infecció per patògens i els possibles mecanismes moleculars involucrats. El nostre laboratori va descobrir que les RNases tenen una activitat antimicrobiana directa davant de diverses espècies bacterianes in vitro, el que suggereix una funció fisiològica de defensa l'hoste. En aquesta tesi doctoral, l'objectiu principal és comprendre com funcionen les RNases humanes en les cèl·lules innates humanes enfront de la infecció per patògens. La majoria de la investigació presentada en aquesta tesi es basa en 4 articles publicats, 1 manuscrit enviat i 1 en preparació. A continuació s'inclou una descripció de cada un dels capítols que constitueixen aquesta tesi:

El primer capítol va resumir el mecanisme antipatogènic dels pèptids i proteïnes antimicrobianes humanes en les infeccions per micobacteris i les seves teràpies aplicades contra la tuberculosi.

El segon capítol va revisar les funcions de regulació immunològica de la superfamília de la RNAsa A. Es descriuen els 8 membres en humans de la família de la RNasa A en funció de la seva contribució a la immunitat innata i el seu rol en l'espai extracel·lular.

Aquest tercer capítol es va centrar en la detecció dels perfils antimicrobians de les RNases humanes contra M. aurum i la identificació de la seva capacitat per induir l'autofàgia en els macròfags infectats. A més, trobem que les activitats antimicrobianes i autofàgiques no depenien de l'activitat enzimàtica RNasa.

En el quart capítol, es va comparar el transcriptoma dels macròfags tractats amb RNasa3 i RNasa3-H15A (un mutant sense activitat catalítica) per identificar el mecanisme molecular de l'acció immunoreguladora de la proteïna. A més, es va sobre expresar la RNasa3 endògena en cèl·lules THP1 derivades a macròfags i es va analitzar el seu efecte sobre la infectivitat per Mycobacterium aurum i el Virus Respiratori Sincitial (RSV). Es van identificar les activitats de immunoreguladores de la RNasa3 en macròfags, amb i sense activitat ribonucleolítica. Proposem que la RNasa3 s'uneix directament al receptor EGFR. D'altra banda, els productes d'ARN escindits per la RNasa3 poden ser responsables de la resposta immune de macròfags dependent de l'activitat ribonucleolítica.

En el cinquè capítol, es van editar gens mitjançant CRISPR / CAS9 per eliminar la RNasa2 en cèl·lules THP1 derivades a macròfags. A continuació, es va comparar la infectivitat de l'RSV, el canvi en el transcriptoma i la població de tRNA en cèl·lules amb i sense RNasa2 endògena. Els nostres resultats van indicar que la RNasa2 és crucial en el control de la infecció intracel·lular de macròfags pel RSV. L'anàlisi del transcriptoma suggereix una interacció directa de la RNasa2 amb el receptor EGFR. A més, en examinar una biblioteca de fragments de tRNA es van identificar fragments de tRNA produïts per la RNasa2 que podrien participar en la inhibició de la infecció vírica.

En el sisè capítol, vam analitzar l'especificitat del substrat enzimàtic en el lloc d'unió de la base del nucleòtid secundari i vam realitzar una caracterització cinètica dels tipus d'RNases canòniques juntament amb una simulació per dinàmica molecular dels membres més representatius de la família. Els resultats destaquen una tendència evolutiva en vertebrats d'ordre inferior a superior cap a una discriminació millorada de preferència per l'adenina respecte a la guanina. L'estudi té com a objectiu identificar la base estructural per al reconeixement específic de substrats d'ARN cel·lular.

En conclusió, els resultats presentats en aquesta tesi contribueixen a comprendre la funció de les RNases en les cèl·lules immunes innates i com faciliten l'eliminació de patògens per part de l'hoste, la qual cosa és crucial per dissenyar i desenvolupar nous agents terapèutics.

La tesis se centró en el análisis de la función biológica de las RNasas humanas, destacando la acción de regulación inmunológica en macrófagos para combatir la infección por patógenos y los posibles mecanismos moleculares involucrados. Nuestro laboratorio descubrió que las RNasas tienen una actividad antimicrobiana directa frente a diversas especies bacterianas in vitro, lo que sugiere una función fisiológica de defensa del huésped. En esta tesis doctoral, el objetivo principal es comprender cómo funcionan las RNasas humanas en las células innatas humanas frente a la infección por patógenos. La mayoría de la investigación presentada en esta tesis se basa en 4 artículos publicados, 1 manuscrito enviado y 1 en preparación. A continuación se incluye una descripción de cada uno de los capítulos que constituyen esta tesis:

El primer capítulo resumió el mecanismo antipatógeno de los péptidos y proteínas antimicrobianas humanas en las infecciones por micobacterias y sus terapias aplicadas contra la tuberculosis.

El segundo capítulo revisó las funciones de regulación inmunológica de la superfamilia de la RNasa. Se describen los 8 miembros en humanos de la familia de la RNasa A en función de su contribución a la inmunidad innata y su rol en el espacio extracelular.

Este tercer capítulo se centró en la detección de los perfiles antimicrobianos de las RNasas humanas contra M. aurum y la identificación de su capacidad para inducir la autofagia en los macrófagos infectados. Además, encontramos que las actividades antimicrobianas y autofágicas no dependían de la actividad enzimática RNasa.

En el cuarto capítulo, se comparó el transcriptoma de los macrófagos tratados con RNasa3 y RNasa3-H15A (un mutante sin actividad catalítica) para identificar el mecanismo molecular de la acción inmunoreguladora de la proteína. Además, sobre expresamos la RNasa3 endógena en células THP1 derivadas a macrófagos y analizamos su efecto sobre la infectividad por Mycobacterium aurum y el Virus Respiratorio Sincitial (RSV). Identificamos las actividades de inmunoregulación de la RNasa3 en macrófagos, con y sin actividad ribonucleolítica. Proponemos que la RNasa3 se une directamente al receptor EGFR. Por otro lado, los productos de ARN escindidos por la RNasa3 pueden ser responsables de la respuesta inmune de macrófagos dependiente de la actividad ribonucleolítica.

En el quinto capítulo, se editaron genes mediante CRISPR / Cas9 para eliminar la RNasa2 en células THP1 derivadas a macrófagos. A continuación, se comparó la infectividad del RSV, el cambio en el transcriptoma y la población de tRNA en células con y sin RNasa2 endógena. Nuestros resultados indicaron que la RNasa2 es crucial en el control de la infección intracelular de macrófagos por el RSV. El análisis del transcriptoma sugiere una interacción directa de la RNasa2 con el receptor EGFR. Además, al examinar una biblioteca de fragmentos de ARNt identificamos los fragmentos de ARNt producidos por la RNasa2 que podrían participar en la inhibición de la infección vírica.

En el sexto capítulo, analizamos la especificidad del sustrato enzimático en el sitio de unión de la base del nucleótido secundario y realizamos una caracterización cinética de los tipos de RNasas canónicas junto con una simulación por dinámica molecular de los miembros más representativos de la familia. Los resultados destacan una tendencia evolutiva en vertebrados de orden inferior a superior hacia una discriminación mejorada de preferencia por la adenina respecto a la guanina. El estudio tiene como objetivo identificar la base estructural para el reconocimiento específico de sustratos de ARN celular.

En conclusión, los resultados presentados en esta tesis contribuyen a comprender la función de las RNasas en las células inmunes innatas y cómo facilitan la eliminación de patógenos por parte del huésped, lo cual es crucial para diseñar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos.

The thesis focused on the biological function analysis of human RNases, emphasizing the immune-regulation action within human macrophages to fight pathogen infection and the potential molecular mechanisms involved. Our laboratory has extensively studied human RNases and found that RNases have a direct antimicrobial activity against diverse bacterial species in vitro, suggesting a physiological host-defense function. In this doctoral thesis, the main goal is to understand how human RNases function in human innate cells against pathogen infection. The majority of the research presented in this thesis is taken from 4 published papers, 1 manuscript submitted and 1 in preparation. Below is a description of each chapter within this thesis:

The first chapter mainly summarized the antipathogenic mechanism of human antimicrobial peptides and proteins in mycobacterial infections and their applied therapies against tuberculosis.

The second chapter reviewed the immune-regulation functions of human RNase superfamily. 8 human RNase A family members were summarized based on their contribution to innate immunity at the extracellular space.

This third chapter focused on screening the antimicrobial profiles of human RNases against M. aurum and identifying their ability to induce autophagy in infected macrophages. Moreover, we found that the antimicrobial and autophagy activities were not dependent on the RNase enzymatic activity.

In the fourth chapter, the transcriptome of macrophages treated with RNase3 and RNase3-H15A (a catalytic defective mutant) were compared to identify the molecular mechanism of the immune-regulation action of RNase3. Moreover, we overexpressed the endogenous RNase3 in THP1 derived-macrophage cells and analyzed its effect on the infectivity by Mycobacterium aurum and the Respiratory Syncytial Virus. We identified RNase3 immune-regulation activities on macrophages, either in a ribonucleolytic-dependent or independent manner. We propose that RNase3 directly targets the EGFR receptor. On the other hand, the RNA products cleaved by RNase3 may be responsible for the ribonucleolytic-dependent macrophage immune response.

In the fifth chapter, CRISPR/Cas9 gene editing tool was applied to knock out RNase2 in macrophage THP1 cells. Then, RSV infectivity, transcriptome change, and tRNA population were compared in cells with and without endogenous RNase2. Our results indicated that RNase2 is crucial in controlling the macrophage intracellular RSV infection. Transcriptome analysis suggests a direct interaction of RNase2 with the EGFR receptor. In addition, by screening a library of tRNA fragments we identified the tRNA fragments produced by RNase2 that might participate in the virus infection inhibition.

In the sixth chapter, we analyzed the enzyme substrate specificity at the secondary nucleotide base binding site and performed a kinetic characterization of the canonical RNase types together with a molecular dynamic simulation of the selected representative family members. The results highlight an evolutionary trend from lower to higher order vertebrates towards an enhanced discrimination for adenine respect to guanine preference, The RNase binding involves specific bidentate polar and electrostatic interactions: Asn to N1/N6 and N6/N7 adenine groups in mammals versus Glu/Asp and Arg to N1/N2, N1/O6 and O6/N7 guanine groups in non-mammals. The study aims to identify the structural basis for the specific recognition of cellular RNA substrates.

In conclusion, the results presented in this thesis contribute to understand the role of RNases in innate immune cells and how they facilitate the host clearance of pathogens, which is crucial for designing and developing new therapeutic agents.