The role of stat3 phosphorylation state in clear cell renal cell carcinoma (ccRCC)

Abstract

STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) és un factor de transcripció latent que regula la transcripció de gens relacionats amb processos biològics essencials tals com: la diferenciació cel·lular, la proliferació, la migració, la inhibició de l’apoptosi i la supervivència. L’activació anormal d’STAT3 s’ha relacionat amb el desenvolupament d’aproximadament el 50% dels càncers humans, incloent el carcinoma renal de cèl·lula clara (ccRCC). Actualment, les propietats oncogèniques d’STAT3 s’atribueixen a la fosforilació del seu residu Tyr705; no obstant, recentment, la fosforilació de la Ser727 ha sorgit com un esdeveniment capaç d’amplificar l’activitat transcripcional d’STAT3, juntament a activitats no genòmiques que promouen el desenvolupament del càncer. El nostre grup va ser un dels pioners en assenyalar la importància de la fosforilació de la Ser727, demostrant que els nivells d’expressió de la pSer727 al nucli (en mostres de teixit de pacients de ccRCC) correlacionaven amb un mal pronòstic i una baixa supervivència global. Donat que el ccRCC és el subtipus histològic de carcinoma renal més prevalent i letal, i que els mecanismes subjacents al seu desenvolupament no han estat determinats fins el moment, l’objectiu d’aquest treball va ser elucidar el paper de l’estat de fosforilació d’STAT3 en el desenvolupament del ccRCC i, específicament, en estudiar la contribució de la pSer727 en la progressió tumoral. Amb aquesta finalitat, es varen generar fosfomutants simples i dobles d’STAT3 (Tyr705Phe, Ser727Ala, Ser727Asp, Tyr705Phe/Ser727Ala, i Tyr705Phe/Ser727Asp) que van ser transduïdes en línies cel·lulars humanes derivades de ccRCC (769-P i 786-O) per avaluar el seu comportament funcional, així com la conseqüent expressió gènica diferencial mitjançant l’anàlisi de microarray. Els nostres resultats han demostrat que les mutants d’STAT3 que contenien una substitució fosfomimètica de la Ser727 (Ser727Asp) promouen un fenotip pro-tumoral in vivo de manera independent a la Tyr705. A més, es descriu que l’estat de fosforilació global d’STAT3 determina l’expressió de diferents subconjunts de gens associats a diversos processos biològics, essent els gens dependents de la pSer727 els més relacionats amb processos característics amb el desenvolupament del càncer. En resum, aquest treball constitueix el primer anàlisi de quin és el paper de l’estat de fosforilació global d’STAT3 en el ccRCC, i demostra que la pSer727 activa la senyalització d’STAT3 a través de la transcripció d’un subconjunt específic de gens que són clínicament rellevants com potencials dianes terapèutiques i nous biomarcadors del ccRCC.

STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) es un factor de transcripción latente que regula la transcripción de genes relacionados con procesos biológicos esenciales, tales como: diferenciación celular, proliferación, migración, inhibición de la apoptosis y supervivencia. La activación anormal de STAT3 ha sido relacionada con el desarrollo de cerca del 50% de todos los cánceres humanos, incluyendo el carcinoma renal de célula clara (ccRCC). Actualmente, las propiedades oncogénicas de STAT3 se atribuyen a la fosforilación de su Tyr705; sin embargo, recientemente, la fosforilación de su Ser727 ha surgido como un evento capaz de amplificar la actividad transcripcional de STAT3, aunada a actividades no genómicas que promueven el desarrollo del cáncer. Nuestro grupo fue uno de los pioneros en señalar la importancia de la fosforilación de la Ser727, al demostrar que los niveles de expresión de pSer727 en el núcleo (en muestras de tejidos de pacientes con ccRCC) correlacionaban con un mal pronóstico y baja supervivencia global. Dado que el ccRCC es el subtipo histológico de carcinoma renal más prevalente y letal, y los mecanismos subyacentes a su desarrollo aún no han sido determinados, el objetivo de este trabajo fue elucidar el rol del estado de fosforilación de STAT3 en el desarrollo del ccRCC, y específicamente, en estudiar la contribución de la pSer727 en la progresión tumoral. Para ello, generamos fosfomutantes simples y dobles de STAT3 (Tyr705Phe, Ser727Ala, Ser727Asp, Tyr705Phe/Ser727Ala, y Tyr705Phe/Ser727Asp) que fueron transducidas en líneas celulares humanas derivadas de ccRCC (769-P y 786-O) para evaluar su comportamiento funcional, así como la consecuente expresión génica diferencial a través de un análisis de microarray. Nuestros resultados demostraron que las mutantes de STAT3 que contenían una substitución fosfomimética para la Ser727 (Ser727Asp) promueven un fenotipo pro-tumoral in vivo de forma independiente de la Tyr705. Además, describimos que el estado de fosforilación global de STAT3 determina la expresión de diferentes subconjuntos de genes asociados a distintos procesos biológicos, siendo los genes dependientes de la pSer727, los más relacionados con procesos característicos del desarrollo del cáncer. En resumen, este trabajo constituye el primer análisis acerca del rol del estado de fosforilación global de STAT3 en el ccRCC, y demuestra que la pSer727 activa la señalización de STAT3 a través de la transcripción de un subconjunto específico de genes que son clínicamente relevantes como potenciales dianas terapéuticas y nuevos biomarcadores para el ccRCC.

The signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is a latent transcription factor that regulates downstream genes involved in essential biological processes such as cell differentiation, proliferation, migration, apoptosis inhibition, and survival. The aberrant activation of STAT3 has been related to the development of near 50% of all human cancers including clear cell renal cell carcinoma (ccRCC). To date, the oncogenic properties of STAT3 are attributed to the phosphorylation of its Tyr705, however, the phosphorylation of its Ser727 has recently emerged as an event that enhances STAT3 transcriptional activity, in addition to non-genomic activities that promote cancer development. Our group was one of the pioneers in bringing the Ser727 phosphorylation to light by demonstrating that nuclear pSer727 expression levels, in tissue samples of ccRCC patients, correlated with poor prognosis and low overall survival. Since ccRCC is the most prevalent and lethal histological subtype of renal cell carcinoma (RCC) and the molecular mechanisms behind its tumorigenesis remain unclear, we aimed to elucidate the role of STAT3 phosphorylation state in ccRCC development, and especially the contribution of pSer727 to tumor progression. For that purpose, we generated simple and double STAT3 phosphomutants (Tyr705Phe, Ser727Ala, Ser727Asp, Tyr705Phe/Ser727Ala, and Tyr705Phe/Ser727Asp) transduced in human-derived ccRCC cell lines (769-P and 786-O), and we evaluated their functional behavior as well as their differential gene expression through microarray analysis. Our data demonstrated that STAT3 mutants carrying a phosphomimetic substitution for Ser727 (Ser727Asp) promote a pro-tumoral phenotype in vitro in a Tyr705-independent manner. Moreover, we describe that the overall STAT3 phosphorylation state determines the expression of different subsets of target genes associated with distinct biological processes, being pSer727-dependent genes the most related to cellular hallmarks of cancer development. In summary, the present study constitutes the first analysis on the role of overall STAT3 phosphorylation state in ccRCC and demonstrates that pSer727 activates STAT3 signaling through transcription of a specific subset of target genes that are clinically relevant as potential therapeutic targets and novel biomarkers for ccRCC.