Functional characterization of the connection between the circadian clock and the DNA damage and repair response in Arabidopsis thaliana

Abstract

En la mayoría de los organismos estudiados, el reloj circadiano mantiene ritmos en fisiología, metabolismo y desarrollo en sintonía con los cambios medioambientales que suceden durante los ciclos diurnos y nocturnos. En plantas, el reloj circadiano regula la correcta periodicidad de muchos procesos cruciales como las respuestas a un gran número de estreses abióticos y bióticos. En esta Tesis Doctoral, hemos estudiado la conexión entre el reloj circadiano y la vía de respuesta al daño y reparación del DNA (DNA Damage and Repair (DDR)) en respuesta al daño de doble cadena del DNA (double strand breaks (DSBs)). Los resultados obtenidos indican que el reloj circadiano rítmicamente regula las respuestas biológicas y moleculares frente a los DSBs. También identificamos al foto-receptor de luz azul CRYPTOCHROME 2 (CRY2) como regulador clave en la repuesta DDR. En respuesta a los DSBs inducidos por la droga bleomicina, nuestros comet assays realizados a diferentes momentos del ciclo diurno mostraron que los DSBs disminuyen por la noche en comparación con los DSBs durante el día. Además, la actividad de los promotores y expresión del mRNA de genes cruciales en la respuesta DDR mostraron oscilaciones rítmicas y robustas con un pico máximo en la noche. Los resultados sugieren que los mecanismos de reparación del DNA podrían estar favorecidos en la noche. La función circadiana no sólo controla transcripción si no también modificaciones post-traduccionales como la parilación de las proteínas. Nuestros estudios mostraron que la sobre-expresión y mutación de un número de genes del reloj circadiano modifica los ritmos de la respuesta DDR. Sin embargo, con algunas excepciones, la expresión de la mayoría de los genes clave del reloj no presenta importantes cambios en respuesta a los tratamientos con bleomicina. Nuestros estudios también mostraron que la desregulación del foto-receptor CRY2 altera el grado de formación de los DSBs y la expresión transcripcional de genes clave en la respuesta DDR como POLY-(ADP-RIBOSE) POLYMERASE 2 (PARP2) y RAD ASSOCIATED WITH DIABETES 51 (RAD51). La regulación podría suceder mediante la interacción directa de CRY2, ya que ensayos de immunoprecipitación de la cromatina revelaron enriquecimiento de la proteína CRY2 en varios loci de genes importantes de la DDR, que incluyen PARP2 y POLY-(ADP-RIBOSE) GLYCOHYDROLASE 1 (PARG1 or TEJ). La correcta expresión y función de CRY2 es también importante en la formación de una clase particular de estructuras secundarias del DNA o híbridos de DNA-RNA conocidos como R-loops. Los resultados que conectan CRY2 con los híbridos de DNA-RNA en los genes de la respuesta DDR son relevantes, ya que los R-loops han sido previamente conectados con la localización y reparación de los DSBs. Mediante el uso de plantas con la función de CRY2 alterada también hallamos que la muerte celular programada y la aparición de hojas verdaderas en respuesta a los DSBs, requieren una correcta expresión y función de CRY2. Por lo tanto, nuestros estudios demuestran una regulación circadiana de la DDR en Arabidopsis thaliana. Esta regulación podría ser relevante para proteger el DNA en momentos en los que es más vulnerable como durante la replicación, que en varios organismos incluidas las plantas, sucede cuando anochece o durante la noche. Nuestros estudios también sugieren que la función de CRY2 en la respuesta DDR podría llevarse a cabo mediante cambios en la compactación de la cromatina y la formación de R-loops.

In most organisms examined to date, the circadian clock sustains rhythms in physiology, metabolism and development in tune with the environmental changes that occur during the day and night cycle. In plants, the circadian clock controls the proper timing of many essential processes including among others plant responses to a number of abiotic and biotic stresses. In this Doctoral Thesis, we aimed to study the connection between the circadian clock and the DNA Damage and Repair (DDR) response triggered by DNA double strand breaks (DSBs). We found that the circadian clock rhythmically regulates molecular and biological responses to DSBs. We also identified the blue-light photoreceptor CRYPTOCHROME 2 (CRY2) as an important regulator of the DDR response. Upon DSB formation by the drug bleomycin, our comet assays performed at different times during the diurnal cycle showed that DSBs are decreased at night compared to DSBs during the day. In addition, the promoter activity and mRNA expression of key DDR genes followed robust rhythmic oscillations with a peak during the night. The results suggest that DNA repair mechanisms might be enhanced at night. The circadian function not only controls transcription but also post-translational modifications such as protein parylation. Our studies showed that over-expression and mutation of a number of circadian clock genes alter the rhythms of the DDR response. However, with some exceptions, the expression of most key clock genes is not importantly affected by bleomycin treatment. Our studies also showed that miss-expression of the photoreceptor CRY2 affects the degree of DSB formation and the transcriptional expression of key DDR response genes including the POLY-(ADP-RIBOSE) POLYMERASE 2 (PARP2) and RAD ASSOCIATED WITH DIABETES 51 (RAD51). The regulation might occur through direct binding as chromatin immunoprecipitation assays revealed the enrichment of CRY2 protein at several key DDR loci including PARP2 and POLY-(ADP-RIBOSE) GLYCOHYDROLASE 1 (PARG1 or TEJ). Proper expression and function of CRY2 is also important for the formation of a particular class of DNA secondary structure or DNA-RNA hybrids known as R-loops. The results connecting CRY2 with DNA-RNA hybrids at the DDR response genes are relevant as R-loops have been previously connected with DSB localization and repairing. By using plants miss-expressing CRY2 we also found that programmed cell death and true leaf emergence in response to DSBs also require proper expression and activity of CRY2. Altogether, our results demonstrate an important role for the circadian clock regulating the timing of the DDR response in Arabidopsis thaliana. This regulation might be relevant for protecting the DNA at a very sensitive time such as during replication, which in several organisms including plants is timed to occur at dusk or during the night. Our studies also suggest that CRY2 function in the DDR response might occur through changes in chromatin compaction and R-loop formation.