Characterization of biomarkers of the generation and functionality of tolerogenic dendritic cells differentiated with vitamin D3

Abstract

En els darrers anys s’ha produït un gran avenç en el desenvolupament de teràpies cel•lulars inductores de tolerància per al tractament de malalties autoimmunitàries tals com l’esclerosi múltiple (EM) i altres patologies immunomediades. Concretament, l’ús de cèl•lules dendrítiques tolerogèniques (tolDC) s’ha convertit en una alternativa terapèutica prometedora en assaigs clínics arreu de tot el món, a causa de la seva potencial capacitat de restablir la tolerància immunitària sense posar en risc la immunitat protectora dels pacients, a diferència dels tractaments convencionals disponibles actualment. Però, l’àmplia varietat de protocols existents per a la generació in vitro d’aquestes tolDC, així com la seva gran heterogeneïtat fenotípica i funcional, han posat de manifest la necessitat de trobar biomarcadors robusts com a un pas fonamental per a l’aplicació d’aquestes cèl•lules dins de l’àmbit clínic, així com per a entendre millor els mecanismes involucrats en la inducció de tolerància immunitària.

En aquest sentit, el principal objectiu d’aquesta tesi ha consistit a identificar i validar biomarcadors comuns de la generació i la funcionalitat de tres dels protocols més freqüents per a la generació de tolDC, utilitzant ja sigui rapamicina (rapa-tolDC), dexametasona (dexa-tolDC) o vitamina D3 (vitD3-tolDC). Però, després de realitzar un estudi mitjançant microarray utilitzant cèl•lules diferenciades de donants sans, no vam ser capaços d’identificar cap gen diferencialment expressat en comparació amb cèl•lules dendrítiques madures (mDC) i immadures (iDC), que fos comú per a aquests tres protocols de diferenciació de tolDC. Tot i això, els nostres resultats van revelar que les dexa-tolDC i les vitD3-tolDC, però no les rapa-tolDC, compartien la modulació de vàries rutes immunoreguladores i antiinflamatòries per a la inducció de tolerància.

A continuació, a causa de les seves potents propietats reguladores, ens vam centrar en l’estudi de les vitD3-tolDC. Així doncs, vam poder validar que l’expressió dels gens CYP24A1, MAP7 i MUCL1 estava fortament induïda en aquestes cèl•lules, tant en mostres de donants sans com de pacients amb EM. En conseqüència, aquests gens poden ser utilitzats com a biomarcadors robusts de la correcta generació de vitD3-tolDC i, per tant, poden ser provats com a controls de qualitat en assaigs clínics per l’EM abans de l’administració d’aquestes cèl•lules als pacients. A més, vam elaborar una xarxa funcional d’interaccions proteiques que va evidenciar que els gens MAP7 i MUCL1 —però no CYP24A1— estaven involucrats en la modulació de vàries rutes rellevants relacionades amb el sistema immunitari, tals com la presentació via HLA de classe II o respostes antiinflamatòries i, consegüentment, podrien tenir un paper crucial en les propietats tolerogèniques de les vitD3-tolDC.

Finalment, amb l’objectiu d’entendre millor els mecanismes desencadenats per les vitD3-tolDC per a la inducció de tolerància immunitària, vam desenvolupar un protocol per a generar i, a continuació, estudiar el perfil transcriptòmic de cèl•lules T CD4+ després de la seva interacció antigen-específica amb vitD3-tolDC mitjançant una anàlisi de RNA-seq. En aquest sentit, els nostres resultats van posar de manifest una important repressió de l’expressió de diversos gens involucrats en el cicle cel•lular i la resposta cel•lular davant de, principalment, estímuls proinflamatoris. Però, només el gen JUNB va poder ser identificat com a un potencial biomarcador de la funcionalitat de les vitD3-tolDC, ja que la seva expressió estava lleugerament induïda a aquelles cèl•lules T CD4+ que van interactuar amb aquestes.

En resum, els resultats presentats en aquesta tesi descriuen el procediment complet de cribratge, selecció i validació de biomarcadors transcriptòmics de la generació —i de la funcionalitat— de vitD3-tolDC, enfocats a la seva translació final a l’àmbit clínic i, per tant, fent de pont entre el laboratori i els pacients.

En los últimos años se ha producido un gran avance en el desarrollo de terapias celulares inductoras de tolerancia para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como la esclerosis múltiple (EM) y otras patologías inmunomediadas. En concreto, el uso de células dendríticas tolerogénicas (tolDC) se ha convertido en una alternativa terapéutica prometedora en ensayos clínicos de todo el mundo, debido a su potencial capacidad de restablecer la tolerancia inmunitaria sin poner en riesgo la inmunidad protectora de los pacientes, a diferencia de los tratamientos convencionales disponibles actualmente. Sin embargo, la amplia variedad de protocolos existentes para la generación in vitro de estas tolDC, así como su gran heterogeneidad fenotípica y funcional, han puesto de manifiesto la necesidad de encontrar biomarcadores robustos como un paso fundamental para la aplicación de estas células en el ámbito clínico, así como para entender mejor los mecanismos involucrados en la inducción de tolerancia inmunitaria.

En este sentido, el principal objetivo de esta tesis consistió en identificar y validar biomarcadores comunes de la generación y la funcionalidad de tres de los protocolos más habituales para la generación de tolDC, utilizando ya sea rapamicina (rapa-tolDC), dexametasona (dexa-tolDC) o vitamina D3 (vitD3-tolDC). Sin embargo, después de realizar un estudio mediante microarray utilizando células diferenciadas de donantes sanos, no fuimos capaces de identificar ningún gen diferencialmente expresado, en comparación con células dendríticas maduras (mDC) e inmaduras (iDC), que fuera común para estos tres protocolos de diferenciación de tolDC. No obstante, nuestros resultados revelaron que las dexa-tolDC y las vitD3-tolDC, pero no las rapa-tolDC, compartían la modulación varias rutas inmunoreguladoras y antiinflamatorias para la inducción de tolerancia.

Posteriormente, debido a sus potentes propiedades reguladoras, nos centramos en el estudio de las vitD3-tolDC. Así, pudimos validar que la expresión de los genes CYP24A1, MAP7 y MUCL1 estaba fuertemente inducida en estas células, tanto en muestras de donantes sanos como de pacientes con EM. Consecuentemente, dichos genes pueden ser utilizados como biomarcadores robustos de la correcta generación de vitD3-tolDC y, por lo tanto, pueden ser probados como controles de calidad en ensayos clínicos para la EM antes de la administración de estas células a los pacientes. Además, elaboramos una red funcional de interacciones proteicas que evidenció que los genes MAP7 y MUCL1 —pero no CYP24A1— estaban involucrados en la modulación de varias rutas relevantes relacionadas con el sistema inmunitario, tales como la presentación vía HLA de clase II o respuestas antiinflamatorias y, consiguientemente, podrían tener un papel crucial en las propiedades tolerogénicas de las vitD3-tolDC.

Finalmente, con el objetivo de entender mejor los mecanismos desencadenados por las vitD3-tolDC para la inducción de tolerancia inmunitaria, desarrollamos un protocolo para generar y a continuación estudiar el perfil transcriptómico de células T CD4+ tras su interacción antígeno-específica con vitD3-tolDC mediante un análisis de RNA-seq. En este sentido, nuestros resultados pusieron de manifiesto una importante represión de la expresión de varios genes involucrados en el ciclo celular y en la respuesta celular ante, principalmente, estímulos proinflamatorios. Sin embargo, tan solo el gen JUNB pudo ser identificado como un potencial biomarcador de la funcionalidad de las vitD3-tolDC, dado que su expresión estaba ligeramente inducida en aquellas células T CD4+ que habían interactuado con las éstas.

En resumen, los resultados presentados en esta tesis describen el procedimiento completo de cribado, selección y validación de biomarcadores transcriptómicos de la generación —y de la funcionalidad— de vitD3-tolDC, enfocados a su traslación final al ámbito clínico y sirviendo, por tanto, como un puente entre el laboratorio y los pacientes.

The last years have witnessed a breakthrough in the development of tolerance-inducing cell therapies for the treatment of autoimmune diseases, such as multiple sclerosis (MS), as well as other immune-mediated pathologies. In particular, tolerogenic dendritic cell (tolDC)-based therapies have become a promising approach in clinical trials worldwide due to their potential ability to restore immune tolerance without compromising the protective immunity of the patients, contrary to conventional and currently available treatments. However, the broad variety of protocols used to generate tolDC in vitro and their functional and phenotypical heterogeneity are evidencing the need to find robust biomarkers as a key point towards their translation into the clinic, as well as better understanding the mechanisms involved in the induction of immune tolerance.

In this regard, the main goal of this thesis was to identify and validate common transcriptomic biomarkers of the generation and functionality of three of the most common tolDC-inducing protocols, using either rapamycin (rapa-tolDC), dexamethasone (dexa-tolDC) or vitamin D3 (vitD3-tolDC) to generate them. However, after performing a microarray study using with cells differentiated from healthy donors, we could not identify any differentially expressed gene in common for these three different tolDC protocols compared to both mature (mDC) and immature dendritic cell (iDC) control conditions. Nevertheless, our results revealed that dexa tolDC and vitD3 tolDC, but not rapa-tolDC, do actually share several immune regulatory and anti-inflammatory pathways towards tolerance induction.

Afterwards, and due to their potent regulatory properties, we focused on the study of vitD3-tolDC. We could validate that CYP24A1, MAP7 and MUCL1 genes were strongly up-regulated in these cells, in samples from healthy donors and MS patients. Therefore, these genes constitute robust biomarkers of the adequate generation of vitD3-tolDC, and thus can be tested as a quality control in clinical trials for MS before the administration of these cells into the patients. Furthermore, we constructed a functional network of protein interactions which evidenced that MAP7 and MUCL1 —but not CYP24A1— were involved in the modulation of many relevant immune-related pathways, such as HLA class II presentation and anti-inflammatory responses, and could have a crucial role in the tolerogenic properties of vitD3-tolDC.

Finally, in order to better understand the mechanisms triggered by vitD3-tolDC for the induction of immune tolerance, we developed a protocol to generate and study the transcriptomic profile of T CD4+ cells upon their antigen-specific interaction with vitD3-tolDC, using an RNA-seq analysis. In this regard, our results evidenced an important down-modulation of several genes involved in cell cycle and in cell responses to, mainly, pro-inflammatory immune-related stimuli. However, only JUNB gene could be identified as a potential biomarker of the functionality of vitD3-tolDC, since its expression was slightly induced in those T CD4+ cells that interacted with them.

Altogether, the results presented in this thesis describe the whole process of screening, selection and validation of transcriptomic biomarkers of the generation —and functionality— of vitD3-tolDC towards their final translation into the clinic, serving as a bridge from the bench to the bedside.