Study of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) nanoparticles and their potential to optimize the cow dry period

Abstract

Hi ha un pla d’acció mundial, sota el lema One Health, fent un clam urgent a minimitzar l’ús d’antibiòtics a tots els nivells –humà, animal i ambiental– en una batalla conjunta contra la crisi associada a la resistència als antimicrobians (AMR) que amenaça la salut global. El desenvolupament de noves estratègies preventives per tractar malalties infeccioses ha esdevingut, doncs, una iniciativa essencial des que l’ús preventiu d’antibiòtics està essent prohibit. En vaquí de llet, el període d’eixugat és una fase sensible durant la qual les vaques són especialment susceptibles a patir infeccions intramamàries, o mastitis, degut a l’estat immunitari temporalment ineficient en què es troba la glàndula mamària. En aquest context, calen alternatives per controlar i reduir la incidència de mastitis durant l’eixugat i, alhora, disminuir l’ús d’antibiòtics. Els cossos d’inclusió (CIs), agregats de proteïna produïts de manera recombinant en bactèries i fàcilment escalables a baix cost, ja han demostrat un gran potencial en àrees de recerca com l’enginyeria de teixits i la teràpia oncològica. Per tal d’explorar el seu potencial en l’àmbit de la producció animal, aquesta tesi s’ha enfocat a cobrir tots els passos cap al desenvolupament, la caracterització i l’aplicació d’aquesta teràpia basada en proteïnes, recent i prometedora, en el sector lleter. La posta a punt d’un protocol de solubilització dels CIs per l’obtenció de la Metal·loproteinasa-9 (MMP-9) en format soluble usant microorganismes classificats com a Generally Recognized As Safe (GRAS), ens ha permès desenvolupar nous sistemes d’alliberament de MMP-9 i comparar-los amb el comportament dels CIs. La gran estabilitat mostrada pels CIs comparada amb d’altres formats ens va fer considerar la seva aplicabilitat in vivo. Com a primer pas, l’administració d’aquests CIs en un model murí va suggerir, per primera vegada, que el seu potencial com a agent immunostimulant podia ser degut a la combinació de dos efectes diferents. Per una banda vam observar un efecte inespecífic i efímer, associat al propi format del CI, i per l’altra vam observar també un efecte específic de la MMP-9 que s’estenia en el temps. Això ens va encoratjar a estudiar quins serien els efectes en el teixit diana proposat en aquest treball, la glàndula mamària bovina en l’eixugat. La MMP-9 no va tenir un efecte específic rellevant accelerant els estadis més primerencs de la involució, però vam observar que aquests agregats proteics acceleraven de 3 a 6 dies l’augment en els nivells de marcadors d’involució, l’alliberament de pèptids bacteriostàtics naturals com ara lactoferrina, i el reclutament de cèl·lules immunitàries a la glàndula mamària, mitjançant un efecte inespecífic. Per tant, aquests resultats consoliden els CIs de MMP-9 com potents agents immunostimulants –tot i que inespecífics– a la glàndula mamària bovina durant l’eixugat, i revela que encara hi ha moltes oportunitats noves per explorar en l’ús de nanopartícules proteiques, per assolir un efecte més específic en l’acceleració de la involució i el sistema immunitari a la glàndula mamària.

There is a worldwide action plan under the motto One Health, calling for the urgent minimization in the use of antibiotics at all levels –human, animal and environmental– in the joint battle against the antimicrobial resistance (AMR) crisis that threatens global health. The development of new preventive strategies to treat infection diseases has become, therefore, an essential initiative since the use of preventive antibiotics is being banned. In dairy cattle, the dry period is a sensitive phase in which cows easily suffer of intramammary infections, or mastitis, due to the temporally inefficient immune condition in the mammary gland. In this context, alternatives are required in order to control and reduce mastitis incidence at dry-off and to diminish the need of antibiotics. Inclusion bodies (IBs), which are protein aggregates recombinantly produced in bacteria and with an easy and low-cost scale-up, have already demonstrated a great potential in research areas such as tissue engineering and cancer therapy. With the aim of exploring their potential into the animal production sector, this thesis has been focused to cover all steps in the way along the development, characterization and application of this novel and promising protein-based therapy in dairy sector. Starting from the acquisition of soluble MMP-9 by solubilizing IBs using a newly described protocol for Generally Recognized as Safe (GRAS) bacteria protein-factories, we have been able to develop new MMP-9 delivery formats and to compare them with IB performances. The greater stability shown by IBs when compared with other formats brought us to consider their applicability in vivo. As a first step, their administration in a murine model revealed for the first time that their potential as an immunostimulant agent could be importantly dissected into two distinct effects. One effect, unspecific and ephemeral, was driven by the IB format whereas the other effect was MMP-9-specific and extended in time. These encouraged us to try to uncover what would be the effects triggered in their ultimate target, the bovine mammary gland at dry-off. Although MMP-9 had not a relevant specific role triggering the early stages of involution in this context, we observed that these protein aggregates accelerated from 3 to 6 days the onset of involution biomarkers, the release of natural bacteriostatic peptides such as lactoferrin, and the recruitment of immune cells in the mammary gland though an unspecific action. Therefore, these results consolidate MMP-9 IBs as a potent immunostimulatory –although unspecific– agent in the bovine mammary gland at dry-off, and reveal that new opportunities are yet to be explored in the use of protein nanoparticles to reach a more specific effect in the acceleration of the mammary gland involution and immune system.