Cell base assays to investigate the functional relevance of HLH genetic variants

Abstract

La linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH) es un trastorno hiperinflamatorio potencialmente mortal causado por una respuesta inmunitaria incontrolada y disfuncional. Las mutaciones en los genes implicados conducen a la forma familiar de la HLH (FHL), que es potencialmente letal en las primeras semanas de vida. La HLH también puede desarrollarse en el contexto de infecciones, tumores malignos, enfermedades autoinflamatorias o metabólicas, pero sin mutaciones. Esta es la llamada HLH secundaria (sHLH). Sin embargo, cada vez hay más pruebas de que los casos típicos de HLH con mutaciones bialélicas y HLH sin defectos genéticos ni inmunológicos representan sólo los extremos del amplio espectro de la HLH. Para profundizar en el conocimiento de la genética de la HLH analizamos el impacto molecular y funcional de mutaciones bialélicas y monoalélicas no identificadas previamente en pacientes diagnosticados con HLH. En este estudio diagnosticamos 12 pacientes con HLH, de los cuales el 75% (n=9) presentaban mutaciones bialélicas y el 25% (n=3) mutaciones monoalélicas. El diagnóstico de estos pacientes permitió la novedosa descripción de 4 mutaciones no identificadas previamente. Entre ellas, describimos una mutación en perforina (p. Pro477X en homocigosidad), dos mutaciones en STXBP2 (L243R como compuesto heterocigótico con otra mutación y R190C como monoalélico) y tres en UNC13D (P271S, R928C y R1075Q como monoalélico). Además, también incluimos en la caracterización once mutaciones en STXBP2 reportadas en la literatura como monoalélicas pero aún no caracterizadas. Describimos que la nueva mutación bialélica L243R se encuentra en un sitio altamente preservado a nivel evolutivo que actúa como centro de una rica red de interacciones importantes para estabilizar los dominios 2 y 3 de la proteína STXBP2. Además, en el estudio de la mutación monoalélica evaluamos la desestabilización estructural y los niveles de expresión de las proteínas mediante la transfección de diferentes construcciones que contienen mutaciones monoalélicas en STXBP2 y UNC13D. Las mutaciones STXBP2 mostraron un efecto hipomórfico mientras que la expresión de la proteína UNC13D no se vio afectada por ninguna de las mutaciones estudiadas. Por lo tanto, se evaluó el efecto de estas mutaciones en las interacciones proteína a proteína y se encontró que la capacidad de interacción se mantuvo dentro de la normalidad en los partners estudiados. Para las mutaciones sin efectos sobre los niveles de expresión y de interacción proteína-proteína, se trató su efecto como negativo dominante mediante un ensayo de desgranulación. Demostramos que el mutante STXBP2-R190C actúa como un negativo dominante, produciendo una disminución de la desgranulación en comparación con los controles. Finalmente, se estudió si las mutaciones descritas que involucran genes en la vía citotóxica tenían un impacto funcional sobre los macrófagos y los linfocitos B. Para ello, analizamos el papel de STXBP2 en el proceso de tráfico celular. Nuestros datos demuestran que en ausencia de STXBP2 hay una acumulación de CD103 en la superficie de células activadas por LPS + IFNg en comparación con los controles, lo que demuestra una interrupción activa del tráfico endosómico. Además, también mostramos una reducción de la desgranulación dependiente de CD107a cuando se utilizan células Knock down. Por lo tanto, las mutaciones en STXBP2, involucrado en la vía citotóxica, parecen tener un impacto funcional sobre los macrófagos y linfocitos B a nivel de tráfico endosómico. En general, este trabajo describe varias mutaciones no identificadas anteriormente relacionadas con la HLH y revela sus efectos a nivel de proteína. Además, estos resultados representan un enfoque primario en la comprensión de la función de STXBP2 en los macrófagos y linfocitos B.

Hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) is a life-threatening hyperinflammatory disorder caused by an uncontrolled and dysfunctional immune response. Biallelic mutations in involved genes leads to the familial form of HLH (FHL) which is potentially lethal in the first weeks of life. HLH can also develop in the context of infections, malignancies, autoinflammatory or metabolic diseases but without mutations. This is the so called secondary HLH (sHLH). Nevertheless, there is an increasing evidence that typical FHL cases with biallelic mutations and sHLH without genetic and immunological defects represent only the extremes of the wide spectrum of HLH. To deepen the understanding in the genetics of HLH we analyzed the molecular and functional impact of previously unidentified biallelic and monoallelic mutations in patients diagnosed with HLH. In this study we diagnosed 12 patients with HLH, of which 75% (n=9) presented biallelic mutations and 25% (n=3) monoallelic mutations. The diagnosis of these patients allowed the novel description of 4 mutations not previously identified. Among those, we describe one mutation in perforin (p. Pro477X in homozygosity), two mutations in STXBP2 (L243R as compound heterozygous with other mutation and R190C as monoallelic) and three in UNC13D (P271S, R928C and R1075Q as monoallelic). Moreover, we also included into the characterization eleven mutations in STXBP2 reported in the literature as monoallelic but not yet characterized. Here, we describe that the novel biallelic mutation L243R is found in an evolutionarily highly preserved site acting as the center of a rich network of interactions important for stabilizing domains 2 and 3 of the STXBP2 protein. Moreover, on the study of monoallelic mutation we assessed protein structural destabilization and expression levels by transfecting different constructs containing monoallelic mutations on STXBP2 and UNC13D. STXBP2 mutations showed an hypomorphic effect while UNC13D protein expression was not affected by any of the studied mutations. As so, we evaluated the effect of these mutations into protein-to-protein interactions and found that interaction capacity was maintained within the studied partners. For mutations with no effects on the expression levels and protein-to-protein interaction, we addressed their effect as dominant negative by a degranulation assay. We show that mutant STXBP2R190C acts as a dominant negative, producing a decrease in degranulation compared to the controls. Finally, we studied whether the described mutations that involve genes in the cytotoxic pathway had functional impact on macrophages and B lymphocytes. For that, we analyzed the role of STXBP2 in the cellular traffic process. Our data demonstrate that in the absence of STXBP2 there is an accumulation of CD103 on the surface of LPS + IFNg activated cells compared to controls, demonstrating an active disruption of endosomal trafficking. Moreover, we also show reduction of CD107a dependent degranulation when using KD cells. Thus, mutations in STXBP2, which is involved in the cytotoxic pathway, appear to have a functional impact on macrophages and B lymphocytes at endosomal trafficking level. Overall, this work describes several previously unidentified mutations related to FHL and sHLH and unveils their effects at a protein level. Moreover, these results represent a primary approach in the understanding of STXBP2 role in macrophages and B lymphocytes.