Valorización de digestato como sustrato para la producción de biopesticidas con Bacillus thuringiensis mediante fermentación en estado sólido

Abstract

Aquesta tesi és part del projecte DECISIVE, finançat pel programa europeu H2020 (acord de subvenció N° 689.229), que té com a objectiu proposar i provar un esquema de gestió descentralitzada per a la valorització dels residus sòlids orgànics municipals. L'objectiu general d'aquesta investigació és la producció de bioproductes de valor afegit a partir del digestat de fracció orgànica de residus sòlids municipals com a substrat mitjançant l'ús de la fermentació en estat sòlid (FES). El principal bioproducte a explorar és un biopesticida inoculant el digestat amb Bacillus thuringiensis (Bt), conegut per les seves propietats biopesticides. En primer lloc, es van realitzar proves a escala laboratori per comprovar la idoneïtat del digestat per a l'obtenció de diferents bioproductes (cel·lulases, soforolípids, proteases i biopesticides), aconseguint els millors resultats de producció per al biopesticida produït per Bt. Aquests experiments es van realitzar amb digestat estèril i digestat higienitzat, observant que aquest microorganisme era capaç de créixer i esporular utilitzant digestat higienitzat. Posteriorment, es van estudiar un seguit d'estratègies d’operació en reactors aïllats tèrmicament de 10-L amb digestat higienitzat. El procés es va escalar a un reactor de 100-L de llit empacat sense aïllament i amb agitació, observant una esporulació del 89% amb un creixement d'espores 3 vegades més gran que l'inicial, mostrant produccions de biopesticida a partir de Bt. Posteriorment, es va realitzar una comparació entre dues soques de Bt, Bacillus thuringiensis subespècie kurstaki (Btk) i Bacillus thuringiensis subespècie israelensis (Bti). Es va avaluar la diferència de les dues soques a escala laboratori 0.5-L observant els efectes d'esterilització, la higienització i la congelació del digestat en la producció de cèl·lules viables i espores per Btk i Bti. Paral·lelament, es van realitzar proves de conservació, anàlisi microbiològic i bioassaigs del digestat. Amb tots els resultats anteriors, els últims anàlisis realitzats en aquesta tesi van ser l'optimització de l'extracció i caracterització de la toxina produïda per Bt a partir del cristall proteic, concentrat i conservat a través de tècniques com: la disrupció, on es van disminuir les cèl·lules viables i es va incrementar la producció d'espores, desprenent el cristall proteic i la liofilització per conservar el material, on es va observar un 86 i 89% de recuperació de les espores per Btk i Bti. Es va realitzar una purificació del substrat, determinant les proteïnes característiques de Bt amb efecte biopesticida a partir d'una electroforesi. Aquesta tesi és un pas endavant per comprovar les característiques del cristall proteic de Bt amb efecte biopesticida a partir de FES i poder utilitzar el producte final valoritzant així el residu del tractament de la fracció orgànica de residus municipals.

Esta tesis es parte del proyecto DECISIVE, financiado por el programa europeo H2020 (acuerdo de subvención N ° 689229), que tiene como objetivo proponer y probar un esquema de gestión descentralizada para la valorización de los residuos sólidos orgánicos urbanos. El objetivo general de esta investigación es la producción de bioproductos de valor añadido a partir del digestato de fracción orgánica de residuos sólidos municipales como sustrato mediante el uso de la Fermentación en Estado Sólido (FES). El principal producto a explorar es un biopesticida a obtener inoculando el residuo con Bacillus thuringiensis (Bt), que produce un cristal proteico con propiedades biopesticidas. En primer lugar, se realizaron pruebas a escala laboratorio para comprobar la idoneidad del digestato para la obtención de diferentes bioproductos (celulasas, soforolípidos, proteasas y biopesticidas), alcanzando los mejores resultados de producción para el biopesticida producido por Bt. Posteriormente, se probaron una serie de estrategias de producción en reactores aislados térmicamente de 10-L con digestato higienizado pasando a escalar el proceso a un reactor de 100-L de lecho empacado sin aislamiento y con agitación observando una esporulación del 89% con un crecimiento de esporas 3 veces mayor que el inicial. Posteriormente, se realizó una comparación entre dos cepas de Bt, Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki (Btk) y Bacillus thuringiensis subespecie israelensis (Bti). Se evaluó la diferencia en el crecimiento y esporulación de ambas cepas a escala laboratorio (0.5-L) observando los efectos de la esterilización, la higienización y la congelación del digestato en la producción de células viables y esporas por Btk y Bti. Después de evaluar los efectos a escala laboratorio y en relación con los experimentos realizados con reactores aislados de 10-L, se estudia el crecimiento de ambas cepas en estos reactores con 1.5 kg de residuo para evitar los incrementos de temperatura, comparándolos con dos tipos de sustrato: digestato y digestato con fracción orgánica de residuos municipales (FORM) (50:50). Paralelamente, se realizaron pruebas de conservación, análisis microbiológico y bioensayos del bioproducto. Con todos los resultados anteriores, las últimas pruebas realizadas en esta tesis fueron la optimización de la extracción y caracterización de la toxina producida por Bt a partir del cristal proteico, concentrado y conservado a partir de técnicas como: la disrupción, y la liofilización, para conservar el material, donde se observó un 86 y 89% de recuperación de las esporas para Btk y Bti. Se realizó también una purificación del sustrato, para la determinación de las proteínas con efecto biopesticida caracteristicas de Bt a partir de una electroforesis. Esta tesis es un paso adelante para comprobar las posibilidades de obtención del cristal proteico de Bt con efecto biopesticida a partir de FES y poder utilizarlo valorizando los residuos del tratamiento de la fracción orgánica de residuos municipales.

This thesis is part of the DECISIVE project, funded by the European program H2020 (grant agreement No. 689229), which aims to propose and test a decentralized management scheme for the recovery of municipal organic waste. The general objective of this research is the production of value-added bioproducts using digestate of the organic fraction of municipal solid waste as a substrate through solid-state fermentation (SSF). The main bioproduct to explore is a biopesticide inoculating the digestate with Bacillus thuringiensis (Bt), which is known to produce a protein with biopesticidal properties. Firstly, laboratory scale tests were performed to verify the suitability of the digestate to obtain different bioproducts (cellulases, sophorolipids, proteases and biopesticides), achieving the best production results for the biopesticide produced by Bt. These experiments were performed with sterile digestate and hygienized digestate, observing that Bt was able to grow and sporulate using hygienized digestate. Subsequently, a series of operational strategies were studied in thermally insulated 10-L reactors using hygienized digestate. The same process was scaled to a 100-L stirred packed bed reactor without thermal insulation observing a sporulation of 89% with a spore growth 3 times greater than the initial value. Subsequently, a comparison was made between two strains of Bt, Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki (Btk) and Bacillus thuringiensis subspecies israelensis (Bti). The difference among both strains at laboratory scale 0.5-L was evaluated observing the effects of sterilization, sanitation and freezing of digestate in the production of viable cells and spores by Btk and Bti. At the same time, conservation tests, microbiological analysis and digestate bioassays were performed. With all the previous results, the last analysis carried out in this thesis was the optimization of the extraction and characterization of the toxin produced by Bt from the protein crystal. Different techniques were applied to concentrate and preserve the protein crystal. The first one was a disruption where viable cells were decreased and spore production increased, releasing the protein crystal. The second one was a lyophilization to conserve the material, where 86 and 89% recovery of spores was observed for Btk and Bti. This thesis is a step forward to verify the characteristics of the Bt protein crystal with biopesticidal effect obtained through SSF and to be able to use the final product valorising the residues of the treatment of the organic fraction of municipal solid waste.