Synonymous changes in the human immunodeficiency virus genome as a strategy to study virus biology

Abstract

La recodificación sinónima de los genomas se ha usado ampliamente para estudiar diferentes aspectos de la biología de los virus. Esta herramienta se basa en modificar la secuencia de nucleótidos de un gen sin cambiar la secuencia de aminoácidos, es decir, la secuencia de la proteína no se ve afectada. Estudios previos han demostrado atenuación viral debida a una reducción en la expresión proteica después de llevar a cabo la recodificación sinónima. De la misma manera, esta herramienta ha permitido la identificación de estructuras secundarias del ARN, la descripción de factores virales o interacciones con el sistema inmune innato, así como desentrañar la regulación temporal de los genes virales. En este trabajo hemos recodificado sinónimamente los genes de la proteasa y de la envuelta (Env) del Virus de Inmunodeficiencia Humana 1 (HIV-1). Comparamos el desarrollo de resistencias del HIV-1 a inhibidores de la proteasa (IPs) entre el virus salvaje (WT) y un virus sintético (MAX) que lleva una secuencia de la proteasa recodificada en el uso de pares de codones incluyendo 38 mutaciones sinónimas (13%). Los virus WT y MAX no muestran diferencias replicativas. Ambos virus fueron propagados en células MT-4 con la presión selectiva a dos IPs atazanavir (ATV) y darunavir (DRV). Tanto el virus WT como el MAX desarrollaron resistencias fenotípicas a IPs. Análisis clonales de secuenciación masiva revelaron que ambos virus desarrollaron mutaciones de resistencia a ATV y DRV previamente descritas. Sin embargo, las resistencias que desarrollaron las proteasas WT y MAX eran diferentes entre ambas variantes. Nuestros resultados indican que la proteasa recodificada del HIV-1 mostró una robustez y evolvabilidad similar al WT, pero la posición en el espacio de secuencias delinea la evolución de cada espectro mutante. Para estudiar cómo las mutaciones sinónimas afectan a la replicación viral, se diseñaron mutantes de Env que cambiaban el uso de codones y el uso de pares de codones; el número de dinucleótidos CpG también se alteró. La variante sintética del virus Recoded-env resultó letal para la viabilidad del VIH-1 después de cambiar su uso de codones mediante la modificación de 39 nucleótidos (1,5%). Análisis de expresión proteica revelaron que la traducción se había modificado en Recoded-env. Varios mutantes se diseñaron basados en Recoded-env para investigar la letalidad de este mutante. Uno de ellos, Recoded_env_3’Bwt, sólo revirtió a WT dos mutaciones de un mismo codón, el codón 34, localizado en la región codificante gp41. Es de resaltar que esta variante del virus no mostró diferencias en replicación en células MT-4 o PBMCs ni una reducción dramática en expresión proteica en comparación con el WT. El análisis de secuencias de gp41, donde se encuentra localizado el codón 34, demostró que la estructura secundaria del ARN estaba severamente interrumpida en Recoded-env. De la misma forma, después de cambiar el uso de pares de codones de env, se generaron 18 diferentes variantes que optimizaban, deoptimizaban o mantenían neutro el sesgo de pares de codones (CPB). Estas variantes confirmaron la importancia de las sustituciones sinónimas en la región codificante de gp41. Solo una de estas variantes, MinCpG.2, era viable con la región gp41 mutada. Se encontraron diferencias en esta región entre MinCpG.2 y el resto de variantes CPB que explicaban la letalidad. También observamos que dos variantes virales que tenían un CPB optimizado, Max-3’wt y MaxCpG-3’wt, mostraban una capacidad replicativa significativamente reducida cuando se comparó con el WT. Además, las variantes de CPB con diferentes proporciones de CpGs nos permitieron concluir que, en nuestro modelo, un número elevado de CpGs no atenuaba el virus. Nuestros resultados confirman que la recodificación sinónima de un gen o genoma es una herramienta muy útil para descifrar diferentes aspectos de la biología viral.

Synonymous genome recoding has been widely used to study different aspects of viral biology. It is based on modifying the nucleotide sequence of a gene without changing the amino acid sequence, thus the protein sequence is not affected. Previous studies have demonstrated viral attenuation by reduction in protein expression after synonymous recoding. Likewise, this tool has allowed the identification of RNA secondary structures, the description of viral factors or interactions with the innate immune system, as well as unravelling the temporal regulation of viral genes. Here, we synonymously recoded the Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) protease and envelope genes. We compared the development of HIV-1 resistance to protease inhibitors (PIs) between wild-type (WT) virus and a synthetic virus (MAX) carrying a codon pair re-engineered protease sequence including 38 (13%) synonymous mutations. WT and MAX viruses showed indistinguishable replication. Both viruses were subjected to serial passages in MT-4 cells with selective pressure from the PIs atazanavir (ATV) and darunavir (DRV) and they both developed phenotypic resistance to PIs. Ultra-deep sequence clonal analysis revealed that both viruses harbored previously described resistance mutations to ATV and DRV. However, the WT and MAX virus proteases showed different resistance variant repertoires. Our results indicate that HIV-1 recoded protease showed similar mutational robustness and evolvability to WT, but the position in sequence space delineates the evolution of each mutant spectra. To study how synonymous mutations affected virus replication, Env mutants were designed by changing its codon usage and codon pair usage. In addition, the number of CpG dinucleotides were also altered. The synthetic Recoded-env virus variant was lethal for HIV-1 after changing its codon usage by synonymously altering 39 nucleotides (1,5%). Protein expression analyses revealed that translation was modified in Recoded-env. Several mutants were designed based on Recoded-env to further investigate the lethality of this mutant. One of them, Recoded_env_3’Bwt, only reverted to WT two mutations of the same codon, named codon 34, located in gp41 coding region. Interestingly, this virus variant did not show significant differences in replication capacity both in MT-4 cells and PBMCs nor a dramatic decrease in protein production, when compared to WT. Analyzing sequences of gp41 in which codon 34 is located, we concluded that the WT RNA secondary structure was severely disrupted in Recoded-env. Similarly, after changing env codon pair usage, different virus variants which optimized, deoptimized or maintained neutral the codon pair bias (CPB) confirmed the relevance of synonymous substitutions in gp41 coding region. Only one of the virus variants, MinCpG.2, was replicative without reverting gp41 to WT. Differences in this region were found between MinCpG.2 and the rest of the designed CPB variants that 16 explained their lethality. We also observed that two virus variants, Max-3’wt and MaxCpG-3’wt, had significantly lower replication capacity when compared to WT although they had an optimized CPB. Moreover, the CPB virus variants with different number of CpGs allowed us to conclude that, in our model, increasing the number of CpGs did not attenuate the virus. Overall, our results confirmed that synonymous recoding a gene or genome is a useful tool to unravel different aspects of the virus biology.