The red leaf blotch of almond, caused by polystigma amygdalinum, in Catalonia: biology and epidemiology

Abstract

En esta tesis doctoral se han estudiado diversos aspectos biológicos importantes sobre la enfermedad de la mancha ocre del almendro (RLB, por sus siglas en ingles), causada por el hongo ascomiceto P. amygdalinum. Esta enfermedad es una de las enfermedades foliares más importantes en la mayoría de las regiones de la cuenca Mediterránea y Oriente medio, donde se cultiva el almendro, ya que las infecciones graves pueden causar la defoliación prematura del árbol. Los aspectos estudiados están relacionados con: i) La epidemiología de P. amygdalinum en dos regiones productoras de almendra en España; ii) la detección y cuantificación fiables del patógeno, mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), además de iii) el estudio de las bases bioquímicas y moleculares de la diferente susceptibilidad a la RLB en distintas variedades comerciales de almendros. El inóculo primario de P. amygdalinum se encuentra disponible en periodos prolongados en la etapa de crecimiento del cultivo (de enero a agosto). El periodo de infectividad en las dos zonas estudiadas se extendió desde marzo hasta mediados de junio, cuando las temperaturas se situaron entre los 10 y 20°C. El periodo de incubación fue variable en los años estudiados (de 2 a 12 semanas), pero en general disminuyó conforme transcurría el año. Para la detección y cuantificación de P. amygdalinum se diseñaron un par de cebadores específicos en la región ITS del ADN ribosomal del hongo, los cuales demostraron ser altamente sensibles y específicos. Ello permitió detectar el patógeno con bastante exactitud y fiabilidad. Los límites de detección se establecieron en 12 pg de ADN de P. amygdalinum y siete ascosporas en suspensiones de esporas preparadas artificialmente. El desarrollo de un protocolo basado en qPCR permitió cuantificar las ascosporas dispuestas en cintas de plástico, utilizadas habitualmente en los captadores de aire volumétricos, así como la colonización del hongo en hojas infectadas. En esta tesis doctoral también se exploraron los mecanismos de defensa del almendro en relación con la susceptibilidad del cultivo a la enfermedad, identificando algunas de las estrategias físicas y químicas implicadas en la tolerancia del almendro a P. amygdalinum. De esta manera, se ha estudiado la regulación de siete genes relacionados con la defensa de la planta contra la enfermedad, así como la deposición de lignina en dos variedades de almendro (‘Mardía’, tolerante y ‘Tarraco’, susceptible) con una respuesta claramente diferencial a la RLB. ‘Mardía’ mostró una expresión relativa mayor de los genes CAD y DFN1 en las primeras etapas de la aparición de síntomas de la RLB, y con una mayor disposición de lignina en tejidos colonizados por el hongo. Por otro lado, ‘Tarraco’ expresó principalmente los genes HQT y LDOX, relacionados con la biosíntesis del ácido clorogénico y las antocianinas, respectivamente, mientras que la deposición de lignina no fue apreciada con claridad. Nuestros resultados abren la puerta para investigaciones futuras centradas en el desarrollo de un modelo epidemiológico preciso para predecir periodos de riesgo de infección de la RLB, integrando el seguimiento del inóculo primario mediante captadores volumétricos de aire y el método de detección del patógeno basado en la qPCR que se ha desarrollado en esta tesis doctoral. Además, la mejora del conocimiento sobre las bases genéticas y moleculares de la resistencia/tolerancia del almendro a la RLB ayudarán a la obtención de nuevas variedades de almendro con mejores perfiles de tolerancia a la RLB. De esta manera, se ponen las bases para hacer frente a la mancha ocre del almendro de una manera integral y sostenible.

Major biological aspects of the red leaf blotch (RLB) disease of almond, caused by the ascomycete Polystigma amygdalinum, were studied in this PhD Thesis. This disease is one of the most important foliar diseases in most almond-growing regions in the Mediterranean basin and the Middle East, since severe infections may cause a premature defoliation of the tree. Those key aspects were related to i) the epidemiology of P. amygdalinum in two almond-growing regions in Spain, ii) the reliable detection and quantification of the pathogen through quantitative real-time PCR (qPCR), in addition to iii) the search for the molecular and biochemical basis for the differential cultivar susceptibility to the RLB. The primary inoculum of P. amygdalinum was available in extended periods in the growing season (January to August). The infectivity period in both Spanish almond-growing areas extended from March to mid-June when temperatures are in the range 10 to 20°C. The incubation period was variable among all years studied (2 to 12 weeks), but in general decreased with time in the season. For the detection and quantification of P. amygdalinum, a primer pair was designed based on the ITS region of the fungal rDNA, and this was shown to be highly specific and sensitive, enabling to detect the pathogen accurately in naturally infected leaves showing different stages of RLB development. Detection of a minimum of 12 pg of P. amygdalinum DNA, and seven ascospores in artificially-prepared ascospore suspensions were determined to be the limits of detection. The development of a qPCR-based protocol allowed to quantify the amounts of ascospores on plastic tapes which are commonly used in volumetric air samplers as well as the fungal colonization in infected leaves. We explored the plant defence mechanisms related to the cultivar susceptibility by identifying some relevant physical and chemical strategies involved in the almond tolerance to P. amygdalinum. Thus, we studied the regulation of seven defence-related genes as well as the lignin deposition in two almond cultivars (tolerant ‘Mardía’ and susceptible ‘Tarraco’) with highly differential response to RLB. ‘Mardía’ displayed an up-regulation of the CAD and DFN1 genes at early stages of RLB symptom expression, with further lignin deposition in the fungal-colonized tissues. In contrast, ‘Tarraco’ mainly triggered the up-regulation of HQT and LDOX genes, related to chlorogenic acid and anthocyanin biosynthesis pathways, respectively, while lignin deposition was not clearly noticed. Our results open a door to future research focused on developing an accurate epidemiological model to predict infection risk events for RLB, by integrating the monitoring of primary inoculum with the aid of volumetric air samplers and the qPCR-based detection method developed in this thesis. In addition, increasing the knowledge on the genetic and molecular bases of the resistance/tolerance to RLB would help in obtaining new almond cultivars with improved tolerant profiles against the RLB. This way, we aim at facing the control of the red leaf blotch of almond in an integrated and sustainable way.