In vitro effects of pollutants and novel therapeutic approaches for tuberculosis

Abstract

La tuberculosis, una enfermedad causada por Mycobacterium tuberculosis, mata a 1,6 millones de personas al año. El resultado de la infección depende de factores del hospedador, la diversidad del patógeno y de factores externos como la contaminación ambiental. Fumar es un factor de riesgo para la infección, enfermedad, recaída, fallo en el tratamiento y resistencia a fármacos, y se estima que es la causa de un 15% de las muertes por tuberculosis. Los cigarrillos electrónicos se promocionan como productos para dejar de fumar, pero no se ha demostrado que sean inocuos. Por otro lado, la aparición de resistencias a fármacos hace necesario buscar nuevas estrategias en el tratamiento, como la encapsulación de fármacos o potenciando el sistema inmune del hospedador. Este trabajo tiene dos grandes objetivos. El primero es evaluar el impacto del diésel, el vapor del cigarrillo electrónico y el humo del tabaco en macrófagos infectados con M. tuberculosis, como un modelo in vitro de un paciente con tuberculosis expuesto a estos contaminantes. En el Capítulo I se resume la relación entre una mala calidad del aire y la propensión a las infecciones respiratorias. En el Capítulo II se estudió si el diésel estaba relacionado con la tuberculosis. Los resultados sugieren que podría estar involucrado en una peor contención del bacilo intracelular. En el Capítulo III se observó que la exposición al humo/vapor reducía la carga intracelular de M. tuberculosis, debido a un defecto en la fagocitosis. La producción de citoquinas también se vio modificada por la exposición al humo/vapor. En el Capítulo IV se estudió el metaboloma en las fracciones extracelulares e intracelulares de cultivos infectados expuestos al humo/vapor. Las principales diferencias se deben a la maduración de los cultivos, pero el vapor produjo cambios en el metaboloma comparables a los producidos por el humo. En el Capítulo V se investigaron los efectos del humo y fármacos antituberculosos en macrófagos infectados con M. tuberculosis. Los macrófagos tratados con fármacos mostraron una mayor reducción de bacilos intracelulares y la concentración de rifampicina fue menor en muestras expuestas al humo, quizá por una interacción humo-fármaco. El segundo objetivo es evaluar la actividad de las nanopartículas y un inhibidor de virulencia, comparándolo con fármacos libres. En el Capítulo VI fueron probadas nanopartículas de sílice cargadas con rifampicina o isoniazida en macrófagos infectados expuestos al humo. Una baja eficiencia de carga y una alta toxicidad de las nanopartículas hicieron que la encapsulación no supusiese una ventaja frente al antibiótico libre. No se detectaron interacciones humo-nanopartículas. En el Capítulo VII fueron testadas nanopartículas de PLGA cargadas con rifampicina. Estas nanopartículas no fueron citotóxicas, fueron resistentes a condiciones gástricas, mostraron cierta actividad bactericida cuando estaban vacías y una liberación del fármaco sostenida cuando estaban cargadas. Las nanopartículas cargadas fueron más efectivas que la rifampicina libre. Finalmente, en el Capítulo VIII se estudió un inhibidor de una proteína que impide la maduración del fagosoma, impidiendo la supervivencia intracelular del bacilo. Cuando se estudió el efecto combinado del humo, inhibidor y fármacos, el inhibidor resultó ser un candidato prometedor para el tratamiento antituberculoso, especialmente cuando se combinó con rifampicina. En resumen, este trabajo destaca la importancia de hacer políticas ambientales globales y de implementar estrategias para dejar de fumar como parte del tratamiento antituberculoso. Los resultados muestran que el vapor provoca una respuesta inflamatoria que podría favorecer la enfermedad. Debido a la aparición de resistencias, es necesario buscar nuevas alternativas en el tratamiento como nanopartículas o potenciando el sistema inmune. Los resultados muestran que las nanopartículas de PLGA suponen una mejora en el tratamiento, y que añadir inhibidores de factores de virulencia potencia la acción bactericida.

Tuberculosis, a disease caused by Mycobacterium tuberculosis, kills about 1.6 million people every year. The outcome of the infection is conditioned by host factors, diversity of mycobacteria and by external factors like pollution. Smoking is an established risk factor for tuberculosis infection, disease, relapse, fail in the treatment and drug-resistant tuberculosis and it is estimated that 15% of global tuberculosis deaths are attributed to smoking. Electronic cigarettes are usually promoted as smoking cessation devices, although their harmless have not been proven. On the other hand, the emergence of drug resistance and limited pipeline make necessary to look for new therapeutic approaches. Encapsulation of current drugs and host-directed therapies are promising strategies for tuberculosis treatment. There are two main aims in this work. One is to evaluate the impact of diesel, electronic cigarette vapor (e-vapor) and cigarette smoke (CS) on macrophages infected with M. tuberculosis, as an in vitro model of a tuberculosis patient exposed to these pollutants. Chapter I summarizes the relationship between poor air quality and susceptibility to respiratory infections. In Chapter II, diesel, a main contributor to urban pollution, was evaluated for a possible association with tuberculosis, and results suggested that contention of bacilli could be impaired to some extent by diesel pollutants. In Chapter III, it was observed that exposure to CS/e-vapor reduced the intracellular M. tuberculosis burden, due to an impairment of the phagocytosis. The production of cytokines was also modified by exposure to CS/e-vapor. In Chapter IV, it is discussed the metabolomics in extracellular and intracellular fractions of infected cultures exposed to CS/e-vapor. Main differences in metabolites were due to maturation of the cultures, but e-vapor induced changes in the metabolome of THP-1 cells comparable to CS exposure. It was investigated in Chapter V the effects of CS and anti-tuberculosis drugs in macrophages infected with M. tuberculosis. Macrophages treated with drugs showed a reduction in the intracellular burden while rifampicin concentration detected was lower in smoked samples, maybe due to an interaction drugs-CS. Secondly, it was evaluated the activity of nanoparticles (NPs) and one virulence inhibitor compared to free drugs. In Chapter VI, it was tested the activity of silica NPs loaded with rifampicin or isoniazid in human macrophages infected with M. tuberculosis exposed to CS. Poor drug load efficiency and high toxicity of the NPs made that administration of NPs had no advantage comparing to free drugs. No interaction NPs-CS was found. In Chapter VII it was tested the activity of PLGA NPs loaded with rifampicin. NPs were not cytotoxic to macrophages, NPs were resistant to simulated gastric conditions, unloaded NPs had some bactericidal action and loaded NPs had a sustained release of the drug. Loaded NPs showed a more effective reduction of M. tuberculosis intracellular burden than free drugs. Finally, in Chapter VIII we explored a new approach targeting a protein that prevents phagosome maturation, allowing M. tuberculosis to survive inside macrophages. We studied the combined effect of the inhibitor and CS in THP-1 macrophages infected. The inhibitor is a promising candidate as a drug for tuberculosis treatment, especially in combination with rifampicin. In conclusion, this work highlights the importance of making global environmental policies and to implement tobacco cessation strategies as part of the tuberculosis treatment. Results show e-vapor provokes a pro-inflammatory response that could favour tuberculosis disease. Due to drug resistance is inevitable, it is necessary to focus on new therapeutic approaches, as nanoparticles carriers or host-directed therapies. Our results support that the use of loaded PLGA NPs is an improvement compared to free drugs, and targeting virulence factors in addition to drugs administration potentiate the bactericidal effect against M. tuberculosis.