Mecanismos citotóxicos y humorales implicados en la etiopatogénesis de la esofagitis eosinofílica

Abstract

La esofagitis eosinofílica (EEo) és una malaltia inflamatòria crònica de l’esòfag caracteritzada per disfunció esofàgica associada, principalment, a la presència d’eosinòfils intraepitelials. La EEo provoca un deteriorament considerable en la qualitat de vida dels pacients, i els estudis epidemiològics indiquen un augment en la seva prevalença en els darrers anys. Tot i que els mecanismes etiopatogènics no estan del tot esclarits, es considera una malaltia al·lèrgica, donada la resposta clínica i histològica dels pacients a l’eliminació de certs al·lergògens i al tipus d’infiltrat inflamatori en el teixit. Actualment el seu diagnòstic es basa en la presència de 15 o més eosinòfils per camp de gran augment en l’epiteli esofàgic, després de descartar la presència d’altres malalties que cursen amb infiltrat eosinofílic esofàgic.

Tot i el creixent interès d’aquesta entitat clínica, els mecanismes que desencadenen la resposta inflamatòria no estan del tot dilucidats. Així doncs, l’objectiu d’aquest treball ha estat analitzar els integrants de la resposta immunitària, amb especial interès en mediadors de respostes citotòxiques i humorals, i la seva contribució al desenvolupament de la EEo. Per a això s’han desenvolupat tres estudis. En el primer s’ha caracteritzat el perfil de l’infiltrat immunològic en l’esòfag en subjectes sans; en el segon s’ha analitzat la funció dels limfòcits CD8 en la EEo i la seva modulació després del tractament amb inhibidors de la bomba de protons o amb exclusió dietètica, així com els possibles mecanismes en un model cel·lular in vitro; finalment, en el tercer estudi, s’ha avaluat la resposta humoral en el teixit i la seva modulació després de la dieta d’exclusió.

En el primer estudi es va realitzar la caracterització fenotípica de limfòcits T, limfòcits B, macròfags, mastòcits i eosinòfils. Es va demostrar que excepte d’eosinòfils, totes les capes de l’esòfag estan àmpliament infiltrades per aquestes cèl·lules sense observar-se diferències en les diferents regions esofàgics. Pel que fa als estrats histològics, es va identificar que els estrats més densament poblats per a tots els tipus

cel·lulars son la papil·la vascular i la lamina pròpia, seguit de l’epiteli en el cas dels limfòcits i de la capa muscular en el cas de macròfags i mastòcits.

El segon estudi va revelar un major infiltrat de limfòcits CD8+, caracteritzats pel marcador d’activació CD2, en pacients amb EEo que va revertir de forma més eficaç en pacients tractats amb dieta d’exclusió que en pacients tractats amb inhibidors de la bomba de protons. A més, es va identificar un augment d’expressió de diversos gens relacionats amb l’activitat de les cèl·lules CD8, com ara enzims citotòxics (granzima A, granzima B, granulisina...), interleuquines pro-inflamatòries (IL-10, IL- 12B, IL-15) i catepsines relacionades amb activitat peptidasa. En el model in-vitro, la línia cel·lular Het-1A es va fer servir per a l’estudi d’aquesta malaltia, tot i que les limitacions van impedir el desenvolupament del model, mentre que el cultiu de biòpsies esofàgiques ex-vivo sembla ser un mètode més prometedor per a l’estudi de mecanismes citotòxics en l’epiteli esofàgic.

El tercer estudi va identificar un augment d’immunoglobulines (Ig) IgE, IgG i IgG4 totals i IgE i IgG4 específiques enfront d’al·lergògens, expressades en mastòcits i cèl·lules plasmàtiques en l’esòfag de pacients amb EEo. La dieta d’exclusió va revertir la producció d’aquestes immunoglobulines en paral·lel a la millora clínica.

Aquesta tesi contribueix a reforçar el potencial immunològic de l’esòfag i revela la coexistència de mecanismes actius tan citotòxics com humorals en la EEo que són modulats amb el tractament. La presència d’immunoglobulines especifiques enfront d’al·lergògens en l’esòfag representa una nova via per al disseny de dietes eficaces en pacients amb EEo i suposen una aproximació a la medicina personalitzada en aquesta malaltia.

La esofagitis eosinofílica (EEo) es una enfermedad inflamatoria crónica del esófago caracterizada por disfunción esofágica asociada, principalmente, a la presencia de eosinófilos intraepiteliales. La EoE provoca un deterioro considerable en la calidad de vida de los pacientes, tanto niños como adultos, y los estudios epidemiológicos indican un aumento en su prevalencia en los últimos años. Aunque los mecanismos etiopatogénicos no están del todo definidos, se considera una enfermedad alérgica, dada la respuesta clínica e histológica a la eliminación de ciertos alérgenos y al tipo de infiltrado inflamatorio en el tejido. Actualmente su diagnóstico se basa en la presencia de 15 o más eosinófilos en el epitelio esofágico tras descartar la presencia de otras enfermedades que cursan con infiltrado eosinofílico esofágico.

Pese al creciente interés en esta entidad, los mecanismos que desencadenan la respuesta inflamatoria no están del todo dilucidados. Así pues, el objetivo de este trabajo ha sido analizar los integrantes de la respuesta inmunitaria, con especial interés en mediadores de respuestas citotóxicas y humorales, y su contribución al desarrollo de la EEo. Para ello se han desarrollado tres estudios; en el primero se ha caracterizado el perfil inmunitario en el esófago en sujetos sanos; en el segunde ha o analizado la función de los linfocitos CD8 y su modulación tras el tratamiento con inhibidores de la bomba de protones o con excusión dietética, así como los posibles mecanismos en un modelo celular in vitro; y en el tercero se ha evaluado la respuesta humoral en el tejido y su modulación tras la dieta de exclusión.

En el primer estudio se realizó la caracterización fenotípica de linfocitos T, linfocitos B, macrófagos y mastocitos. Se demostró que el esófago está ampliamente infiltrado por estas células sin observarse diferencias en las distintas regiones esofágicas. En cuanto a los estratos histológicos, se identificó que los más densamente poblados para todos los tipos celulares eran la papila vascular y la lamina propia, seguido del epitelio, en el caso de los linfocitos, y de la capa muscular en el caso de macrófagos y mastocitos.

El segundo estudio reveló un mayor infiltrado de células CD8+, caracterizadas por el marcador de activación CD2, en pacientes con EEo que revirtió de forma más eficaz en pacientes tratados con dieta de exclusión que en pacientes tratados con inhibidores de la bomba de protones. Además, se identificó un aumento de expresión de varios genes relacionados con la actividad de las células CD8 como enzimas citotóxicos (granzima A, granzima B, granulisina...) interleuquinas proinflamatorias (IL10, IL12B, Il15) y catepsinas relacionadas con actividad peptidasa. En el modelo in vitro, se utilizó la línea celular Het-1A como modelo experimental, pero ciertas limitaciones no permitieron su desarrollo completo, mientras que la exposición de biopsias esofágicas ex-vivo parece ser una metodología más prometedora para el estudio de mecanismos citotóxicos en el epitelio esofágico.

El tercer estudio identificó un aumento de inmunoglobulinas (Ig) IgE, IgG total e IgG4 específicas frente a alérgenos, expresadas en mastocitos y células plasmáticas en el esófago de pacientes con EEo. La dieta de exclusión revirtió la producción de estas inmunoglobulinas en paralelo a la mejoría clínica.

Esta tesis contribuye a reforzar el potencial inmunológico del esófago y revela la coexistencia de mecanismos activos citotóxicos y humorales en la EEo que son modulados mediante el tratamiento. La presencia de inmunoglobulinas especificas frente a alérgenos en el esófago representa una nueva vía para el diseño de dietas eficaces en pacientes con EEo y suponen una aproximación a la medicina personalizada en esta enfermedad.

Eosinophilic esophagitis (EoE) is a chronic inflammatory disease of the esophagus characterized by esophageal dysfunction and is associated with a dense infiltrate of intraepithelial eosinophils. EoE causes a considerable deterioration in the quality of life of patients, both children and adults, and epidemiological studies indicate a prevalence increase in the last years. Although the etiopathogenic mechanisms are not fully defined, it is considered an allergic disease, given the clinical and histological response to the elimination of certain allergens and the type of inflammatory infiltrate in the tissue. Currently, its diagnosis is based on the presence of 15 or more eosinophils per high power field in the esophageal epithelium after excluding the presence of other diseases with esophageal eosinophilic infiltrate.

Despite the growing interest in this entity, the mechanisms that trigger the inflammatory response are not entirely elucidated. Thus, the objective of this work was to analyze the participants of the immune response, with special interest in mechanisms leading cytotoxic and humoral responses, and their contribution to the development of EoE. For this, three studies were developed. In the first one, the cellular immune profile of the esophagus was characterized in health. In the second study, the function of CD8 lymphocytes and their modulation after treatment with proton pump inhibitors or with dietary food avoidance, were analyzed, as well as the possible mechanisms in an in vitro cell model. In the third study, the humoral response in the tissue and its modulation after the exclusion diet was evaluated.

In the first part, the phenotypic characterization of T lymphocytes, B lymphocytes, macrophages, mast cells and eosinophils was performed. It showed that except for eosinophils, the all esophageal layers are widely infiltrated by these cells without observing differences in the esophageal regions. Regarding the histological strata, it was identified that the most densely populated, for all cell types, were the vascular papilla and the lamina propria, followed by the epithelium in the case of lymphocytes and the muscular layer in the case of macrophages and mast cells.

The second study revealed a greater infiltration of CD8+ lymphocytes, featured by the activation marker CD2, in patients with EoE, which reversed more effectively in patients treated with an exclusion diet than in patients treated with proton pump inhibitors. In addition, an increase in the expression of several genes related to the activity of CD8 cells was identified as cytotoxic enzymes (granzyme A, granzyme B, granulysin...), proinflammatory interleukins (IL10, IL12B, IL15) and cathepsins related to peptidase activity. In the in vitro model, the Het-1A cell line was used as a model for the study of this disease, however some limitations did not allow to fully developing it. Additionally, ex-vivo esophageal biopsy culture seems to be a more promising approach for the study of cytotoxic mechanisms in the esophageal epithelium.

The third study identified an increase in total immunogloblins (Ig) IgE, IgG and IgG4 and specific IgE and against allergens, expressed in mast cells and plasma cells in the esophagus of patients with EoE. The exclusion diet reversed the production of these immunoglobulins in parallel to clinical improvement.

This thesis contributes to reinforcing the immunological potential of the esophagus and reveals the coexistence of cytotoxic and humoral active mechanisms in the EoE that are modulated by treatment. The presence of specific immunoglobulins against allergens in the esophagus represents a new way for the design of effective diets in patients with EoE and represents an approach to personalized medicine in this disease.