Mechanistic insights into substrate-assisted catalysis in glycosidases by means of QM/MM molecular dynamics

Abstract

Carbohydrates are essential molecules in biotechnology and for the proper functioning of living organisms. They are involved in energy storage, being structural components or participating in crucial biological processes such as cellular signaling or the development of diseases. For this reason, carbohydrates have gained great attention among the scientific community. “Carbohydrate-active enzymes” are the catalytic machinery that degrade, synthesize, and modify carbohydrates, even that saccharides show a vast variety of configurations, conformations and stereochemical properties. This thesis is focused on the study of glycosidases, enzymes in charge of hydrolyzing glycosidic bonds. In particular, glycosidases that use the substrate-assisted mechanism, in which the N-acetyl group of the substrate actively participate in catalysis. This reaction mechanism still hinders several mysteries such as the nature of the reaction intermediate, the role of the catalytic residues or the conformational itinerary. The latter corresponds to the conformations that a carbohydrate ring adopts during the enzymatic reaction. Deciphering glycosidase catalytic itineraries and their reaction mechanism boosts the design of specific inhibitors and provides further knowledge of these enzymes. To study glycosidase reaction mechanisms, we used computational techniques based on molecular dynamics, describing the systems with molecular mechanics, quantum mechanics or hybrid methods that combine the benefits from both. We investigated chitinase B from family GH18 that degrades chitin and β-N-acetylglucosaminidases from families GH84 and GH85, which cleave O- and N-glycans, respectively. Furthermore, we elucidated the conformational intrinsic properties of carbohydrates and carbohydrate-based inhibitors related to the substrate-assisted mechanism. In summary, we provide an overview of this reaction mechanism.

Els carbohidrats són molècules primordials tant en l’àmbit biotecnològic com en el bon funcionament de tot organisme. Es troben implicats en el l’emmagatzematge d’energia, són elements estructurals o participen en processos biològics crucials pels éssers vius com ara la senyalització cel·lular o el desenvolupament de situacions patològiques. Per aquest motiu, els carbohidrats han atret l’atenció de la comunitat científica. Els “enzims actius en carbohidrats” són la maquinària catalítica que degrada, sintetitza i modifica els carbohidrats, tot i la gran varietat de configuracions, conformacions i estereoquímiques que aquests presenten. Aquesta present tesi doctoral s’ha dedicat a l’estudi de glicosidases, enzims encarregats d’hidrolitzar enllaços glicosídics. En concret, glicosidases que empren un mecanisme d’assistència de substrat, en el qual el substituent acetil del carbohidrat participa activament en la reacció enzimàtica. Aquest mecanisme de reacció encara amaga incògnites com la naturalesa del intermedi de reacció, la disposició dels residus catalítics o l’itinerari conformacional. Aquesta última característica correspon a les conformacions que adopta un anell de sucre en el centre actiu de l’enzim al llarg de la reacció enzimàtica. Desxifrar aquests itineraris, així com el mecanisme de reacció, permet assistir en el disseny d’inhibidors específics per glicosidases i empènyer més enllà el coneixement sobre aquests enzims. Per realitzar aquesta tasca, s’han usat mètodes computacionals basats en dinàmica molecular, tot descrivint els sistemes estudiats amb mecànica molecular, mecànica quàntica o mètodes híbrids que combinen els avantatges de les anteriors. S’ha investigat la quitinasa B de la família GH18 que degrada el polisacàrid quitina, així com β-N-acetilglicosaminidases de les famílies GH84 i GH85, que tallen O- i N-glicans, respectivament. Així mateix, s’han estudiat les propietats conformacionals de carbohidrats i inhibidors de glicosidases basats en aquests últims per tal de comprendre la inhibició en diverses glicosidases que segueixen el mecanisme d’assistència de substrat. D’aquesta manera, s’ha obtingut una visió general d’aquest mecanisme.