Targeting MYC in B-cell haematologic malignancies

Abstract

La importància de la funció de MYC en el càncer (i l’origen del nom de la oncoproteïna) es va descobrir a finals dels 70, amb la identificació de la seqüència del retrovirus aviar causant de la leucèmia mielocítica. Durant més de 40 anys d’investigació, s’ha subratllat la rellevància d’aquesta proteïna en la divisió cel·lular normal i la seva implicació en la transformació tumoral. De fet, una de les primeres connexions entre la sobreexpressió de proto-oncògens (com MYC), reordenaments gènics i el càncer es va fer en el limfoma de Burkitt, la leucèmia mieloide crònica i els plasmacitomes de ratolí. Tenint en compte el paper de MYC en els càncers, sembla òbvia la necessitat de desenvolupar estratègies terapèutiques contra aquesta proteïna. No obstant, dirigir teràpies contra MYC era i segueix sent, un repte, donades les seves propietats úniques: no disposa d’estructura tridimensional, localització nuclear i absència d’un domini enzimàtic. Malgrat aixó, molts estudis han demostrat l’impacte terapèutic potencial de la inhibició de MYC, ja sigui directa o indirectament. En aquesta tesi, descrivim el potencial de la inhibició directa de MYC en el limfoma de Burkitt (BL) i el mieloma múltiple (MM), fent ús de dues estratègies diferents: petites molècules peptidomimètiques i disruptors del complex MYC / MAX / ADN (la mini-proteïna Omomyc i una variant derivada, anomenada variant 26 o V26): - La validació del potencial terapèutic dels peptidomimètics es va fer en col·laboració amb una startup biotecnològica. Tot i la prometedora eficàcia demostrada in vitro, un cop administrats in vivo, els compostos van provocar toxicitat severa local acompanyada de canvis en el comportament dels animals, fet que ens va portar a suspendre aquesta línia d’investigació. - Pel que fa a la validació de la mini-proteïna Omomyc com a estratègia farmacològica per tractar el BL i el MM, aquí vam mostrar la seva eficàcia in vitro i resultats preliminars en un model de peix zebra, on el pretractament amb Omomyc evita la colonització de la medul·la òssia. D’aquesta manera, s’evidencia per primera vegada l’ús potencial d’aquest “candidat a fàrmac” per al tractament de tumors líquids.

Els nostres resultats in vivo en ratolins mostren que, tot i que l’administració d’Omomyc com a monoteràpia té una eficàcia limitada (probablement a causa d’un lliurament insuficient de pèptid a les cèl·lules de BL i MM), la seva combinació amb un inhibidor del proteasoma (teràpia estàndard del MM) resulta en efectes sinèrgics tant in vitro com in vivo en models de MM. A més, hem demostrat que l’administració intravenosa de Omomyc encapsulada en liposomes és segura i que aquesta formulació liposomal allarga la vida mitjana d’Omomyc en el sèrum, encara que no aconseguim augmentar l’entrada a les cèl·lules diana.

- Per últim, hem caracteritzat la V26, un derivat de Omomyc, dissenyada per millorar la localització nuclear i la capacitat d’escapar dels endosomes. Aquí mostrem que la V26 pot homodimerizar i heterodimerizar amb MAX, a més d’unir-se a l’ADN en qualsevol de les dues formes dimèriques. Tal i com esperàvem, la V26 va mostrar ser més nuclear i va induir mort cellular in vitro. No obstant, també va resultar ser menys soluble que Omomyc, de manera que caldria fer millores en la seva formulació per poder ser utilitzada in vivo. En conjunt, els resultats suggereixen que la mini-proteïna Omomyc, o altres derivats com la V26, poden servir com a base pel disseny de nous fàrmacs anti-MYC pel tractament del BL i del MM. Així mateix, la combinació d’aquests amb les teràpies estàndard podrien constituir una estratègia prometedora, mentre que l’encapsulació en liposomes podria ajudar a resoldre aquells possibles problemes de biodisponibilitat derivats del seu ús in vivo.

La importancia de la función de MYC en el cáncer (y el origen del nombre de la oncoproteína) se descubrió a finales de los años 70, con la identificación de la secuencia del retrovirus aviar causante de la leucemia mielocítica.

Durante más de 40 años de investigación, se ha subrayado la relevancia de esta proteína en la división celular normal y su implicación en la transformación tumoral. De hecho, una de las primeras conexiones entre la sobreexpresión de proto-oncogenes (como MYC), reordenamientos génicos y el cáncer se hizo en el linfoma de Burkitt, la leucemia mieloide crónica y los plasmacitomas en ratón.

Teniendo en cuenta el papel que desempeña MYC en los cánceres, parece obvia la necesidad de desarrollar estrategias terapéuticas contra esta proteína. Sin embargo, dirigir terapias contra MYC era y sigue siendo, un reto, dadas las propiedades únicas que lo caracterizan: su carencia de estructura tridimensional, localización nuclear y ausencia de un "bolsillo" enzimático. A pesar de estas particularidades, muchos estudios han demostrado el impacto terapéutico potencial que tendría la inhibición de MYC, ya sea directa o indirecta.

En esta tesis, describimos el potencial de la inhibición directa de MYC en el linfoma de Burkitt (BL) y el mieloma múltiple (MM), usando dos estrategias distintas: pequeñas moléculas peptidomiméticas y disruptores del complejo MYC/MAX/ADN (la mini-proteína Omomyc y una variante derivada, llamada variante 26 o V26):

- La validación del potencial terapéutico de los peptidomiméticos se hizo en colaboración con una "startup" biotecnológica. A pesar de la prometedora eficacia demostrada in vitro, los compuestos provocaron toxicidad severa local in vivo, además de cambios en el comportamiento de los animales, que nos llevaron a discontinuar la investigación.

- Respecto a la validación de la mini-proteína Omomyc como estrategia farmacológica para tratar el BL y el MM, aquí mostramos su eficacia in vitro y resultados preliminares en un modelo de pez cebra, donde el pretratamiento con Omomyc previene la colonización de la médula ósea. De esta forma, se evidencia por primera vez el uso potencial de este "candidato a fármaco" para el tratamiento de tumores líquidos.

Nuestros resultados in vivo en ratones muestran que, aunque la administración de Omomyc como monoterapia tiene una eficacia limitada (probablemente debido a la insuficiente llegada de péptido a las células de BL y MM), su combinación con un inhibidor del proteasoma (terapia estándar del mieloma) resulta en efectos sinérgicos tanto in vitro como in vivo en modelos de mieloma.

Además, hemos mostrado que la administración intravenosa de Omomyc encapsulada en liposomas es segura y que dicha formulación liposomal prolonga la vida media de Omomyc en el suero, aunque no conseguimos aumentar la entrada en las células diana.

- Por último, hemos caracterizado la V26, un derivado de la mini-proteína Omomyc, diseñada con el objetivo de mejorar la localización nuclear y el escape de los endosomas. Aquí mostramos que, como Omomyc, la V26 puede homodimerizar y heterodimerizar con MAX, además de unirse al ADN en cualquiera de las dos formas diméricas. Como esperábamos, la V26 se mostró más nuclear e indujo muerte celular in vitro. Sin embargo, también resultó ser menos soluble que Omomyc, de forma que sería necesario hacer mejoras en su formulación para poder usarla in vivo.

En conjunto, nuestros resultados sugieren que la mini-proteína Omomyc, u otros derivados, como la V26, pueden servir como base para el diseño de nuevos fármacos anti-MYC para el tratamiento del BL y MM. Además, la combinación de éstos con las terapias estándar podrían constituir una estrategia prometedora, mientras que la encapsulación en liposomas podría ayudar a resolver aquellos posibles problemas de biodisponibilidad derivados de su uso in vivo.

The importance of MYC function in cancer (and the origin of the oncoprotein's name) was discovered in the late '70s when the sequence of the avian retrovirus that causes myelocytic leukaemia was identified.

Since then, over 40 years of unceasing research have highlighted the significance of this protein in regular cell division, and importantly, its involvement in malignant transformation. Indeed, some of the earliest connections between the higher expression of proto-oncogenes (such as MYC), genetic rearrangements and their relation to cancer development were made in Burkitt lymphoma, chronic myeloid leukaemia and mouse plasmacytomas.

Given the role of MYC in cancer, the need for the design of therapeutic strategies against it seems obvious. However, targeting MYC was - and somehow, still is - challenging due to its unique properties: lack of defined three-dimensional, structure nuclear localisation and absence of enzymatic pocket. Despite these difficulties, many studies have shown the potential therapeutic impact of direct or indirect MYC inhibition.

In this thesis, we outline the potential of direct MYC inhibition in Burkitt lymphoma (BL) and multiple myeloma (MM) making use of 3 different strategies: small molecule peptidomimetics and disruptors of the MYC/MAX/DNA complex (Omomyc mini-protein and the derivative variant 26 or V26):

- In the first case, the validation of the peptidomimetics therapeutic potential was done in collaboration with a start-up biotech company. Despite evidencing some promising efficacy in vitro, the compounds displayed severe local toxicity in vivo, accompanied by changes in animal behaviour that prompted us to discontinue the investigation.

- Regarding the validation of Omomyc mini-protein as a pharmacological approach in the treatment of BL and MM, we demonstrated in vitro efficacy and showed preliminary results in the prevention of bone marrow homing upon Omomyc pre-treatment in a zebrafish model, indicating, for the first time, the potential use of this drug candidate to treat liquid tumours.

Our in vivo data in mice show that, even if the administration of Omomyc as monotherapy has limited efficacy (probably due to insufficient delivery of peptide to BL and MM target cells), the combination with a proteasome inhibitor (the standard of care for myeloma) both in vitro and in vivo displays synergic effects in myeloma models.

In addition, we were able to show that intravenous administration of the Omomyc mini-protein encapsulated in liposomes was safe and the liposomal formulation prolonged the serum half-life of the mini-protein, although it did not promote increased penetrance in MM target cells.

- Lastly, we characterised V26, a rationally designed derivative of the Omomyc mini-protein, meant to display improved nuclear localisation and endosomal escape. Here we evidenced that, like Omomyc, V26 can homodimerise and heterodimerise with MAX, as well as bind DNA in both dimeric forms. As expected, V26 displayed better nuclear localisation and induced cell death in vitro. However, it also turned out to be less soluble than Omomyc, indicating that it would require further formulation efforts to be used in vivo.

Altogether, our results suggest that Omomyc mini-protein itself or other Omomyc-derivatives, like V26, can serve as the backbone for the design of new anti-MYC agents to treat BL and MM. In this context, combination therapy with the standard of care seems to be a promising strategy, while encapsulation in liposomes might help to address potential bioavailability issues that might arise from its use in vivo.