Intestinal mucosal humoral response and neuro-immune interaction as contributors to the pathophysiology of diarrhea-predominant Irritable Bowel Syndrome

Abstract

La Síndrome de l’Intestí Irritable (SII) és un trastorn gastrointestinal crònic i prevalent que cursa amb alteracions a la motilitat intestinal i amb dolor abdominal. La SII constitueix un trastorn recurrent i potencialment incapacitant sense un marcador de diagnòstic específic i únicament hi ha disponibles tractaments pal·liatius. L’absència d’una patofisiologia ben establerta destaca la necessitat d’identificar les causes orgàniques subjacents a les alteracions intestinal i la generació de símptomes. A la mucosa intestinals d’aquests pacients s’ha identificat un cert grau d’inflamació així com un increment de la permeabilitat intestinal i una major activitat de la resposta immunitària. Estudis previs del nostre grup van revelar un de la activitat humoral a la mucosa intestinal dels pacients SII amb predomini de diarrea (SII-D), associats a símptomes més severs. Per una altra banda, els pacients que pateixen SII sovint presenten ansietat i depressió recolzant que una disfunció de l’eix cervell-intestí podria estar involucrada en l’aparició i el desenvolupament dels símptomes. Considerant l’alta innervació de l’intestí i la modulació bidireccional descrita entre el sistema nerviós i el sistema digestiu, l’objectiu d’aquesta tesi doctoral és caracteritzar l’activació de la resposta humoral per mecanismes neuro-immunològics a la mucosa intestinal dels pacients amb SII-D.

Per assolir el nostre objectiu, aquest projecte s’ha dividit en tres capítols. Al capítol 1, vam obtenir biòpsies jejunals, sang i femta de pacients amb SII-D i voluntaris sans. Vam quantificar les immunoglobulines (Igs) a les mostres de femta i es va observar que els nivells de IgG són més alts al grup SII-D, concretament IgG2 i IgG3, aquesta última sense diferències significatives. La quantitat de IgG total correlaciona de forma positiva amb la intensitat del dolor abdominal reportada pels pacients. Vam realitzar una anàlisis fenotípica a les biòpsies de l’expressió dels marcadors de cèl·lula plasmàtica CD38/CD138, el marcador neuronal PGP9.5 i TACR1 (receptor de substància P), involucrat a la senyalització nociceptiva. Vam observar que les cèl·lules plasmàtiques i las terminacions nervioses es troben en proximitat i en realitzar la quantificació d’aquesta distància mitjançant microscòpia electrònica de transmissió, els resultats van mostrar que les cèl·lules plasmàtiques estan significativament més properes a les terminacions nervioses al grup SII-D. Aquesta distància correlaciona amb els símptomes d’estrès agut i els nivells de depressió indicats pels pacients, l’últim sense assolir la significació estadística.

Al capítol 2, vam realitzar una anàlisi de RNA-seq amb RNA extret de biòpsies jejunals de pacients amb SII-D i voluntaris sans. Vam dur a terme en aquestes mostres, una anàlisi d’enriquiment del conjunt de gens, vam observar que el fenotip immunològic de la resposta humoral està enriquit i 60% dels gens amb un nivell major d’enriquiment estan involucrats a l’estructura de les Ig. Les vies associades amb la funció barrera a l’intestí també es troben sobrerepresentades a la SII-D.

Finalment, al capítol 3, es van avaluar diferents fonts d’obtenció de cèl·lula B com a model in vitro per estudiar l’efecte dels neuropèptids a l’activitat immunològica, més específicament la substància P, a l’activació/diferenciació de la cèl·lula B i la producció de Ig. Vam comparar cèl·lules de cultiu primari (cèl·lules B i cèl·lules plasmàtiques aïllades de la mucosa intestinal i sang) i una línia de cèl·lula B immortalitzada (126BLCL). També es va fer una anàlisis cèl·lules plasmàtiques diferenciades in vitro obtingudes a partir de les cèl·lules aïllades de sang. Rere una detallada caracterització fenotípica, vam concloure que les cèl·lules B de sang són el model in vitro més adequat i factible.

El Síndrome del Intestino Irritable (SII) es un trastorno gastrointestinal crónico y prevalente que cursa con alteraciones en la motilidad intestinal y dolor abdominal. Constituye un trastorno recurrente y potencialmente incapacitante para el cual no existe un marcador específico diagnóstico ni tratamientos especificos. La ausencia de una patofisiología bien establecida subraya la necesidad identificar las causas orgánicas subyacentes a las alteraciones intestinales y a la generación de síntomas. En la mucosa intestinal de estos pacientes, se ha identificado un cierto grado de inflamación, un incremento de la permeabilidad intestinal y una mayor actividad de la respuesta inmunológica. Estudios previos de nuestro grupo revelaron un incremento de la actividad humoral en la mucosa intestinal de los pacientes con SII con predominio de diarrea (SII-D), asociados a síntomas más severos. Por otra parte, los pacientes que sufren de SII a menudo presentan ansiedad y depresión, sustentando que una disfunción del eje cerebro-intestino podría estar involucrada. Teniendo en cuenta la alta inervación de la mucosa intestinal, juntamente con la modulación bidireccional entre sistema nervioso e inmunitario, el objetivo de esta tesis doctoral es caracterizar la activación de la respuesta humoral por mecanismos neuro-inmunológicos en la mucosa intestinal de los pacientes con SII-D.

Para lograr nuestro objetivo, este proyecto se ha divido en tres capítulos. En el capítulo 1, obtuvimos biopsias yeyunales, sangre y heces de pacientes con SII-D y voluntarios sanos. Cuantificamos las Ig en muestras de heces y observamos que los niveles de inmunoglobulina (Ig) G son más altos en el grupo SII-D, concretamente IgG2 e IgG3, esta última sin alcanzar diferencias significativas. La cantidad de IgG total correlaciona de forma positiva con la intensidad del dolor abdominal reportada por los pacientes. Llevamos a cabo un análisis fenotípico en las biopsias de la expresión de los marcadores de célula plasmática CD38/CD138, el marcador neuronal PGP9.5 y la expresión de TACR1 (receptor de sustancia P), involucrado en la señalización nociceptiva. Observamos que las células plasmáticas y las terminaciones nerviosas se encuentran en proximidad y, cuando realizamos la cuantificación de esta distancia mediante microscopía electrónica de transmisión, los resultados mostraron que las células plasmáticas están significativamente más cerca de las terminaciones nerviosas en SII-D. Esta distancia correlaciona con los síntomas de estrés agudo y los niveles de depresión, el segundo sin llegar a alcanzar la significación estadística.

En el capítulo 2, realizamos un análisis de RNA-seq con RNA extraído de biopsias yeyunales de pacientes con SII-D y voluntarios sanos. En estas muestras llevamos a cabo un análisis de enriquecimiento del conjunto de genes observamos que el fenotipo inmunológico de la respuesta humoral está enriquecido y 60% de los genes con mayor nivel de enriquecimiento están involucrados en la estructura de las Igs. Las vías asociadas con la función barrera en el intestino también se encuentran sobrerrepresentadas en el SII-D.

Finalmente, en el capítulo 3, se evaluaron diferentes fuentes de obtención de célula B como modelo in vitro para estudiar el efecto de los neuropéptidos sobre la actividad inmunológica, más específicamente la sustancia P, en la activación/diferenciación de la célula B y la producción de Igs. Comparamos células de cultivo primario (células B y células plasmáticas aisladas de la mucosa intestinal y sangre) y una línea de célula B inmortalizada (126BLCL). También analizamos células plasmáticas diferenciadas in vitro obtenidas de las células aisladas de sangre. Tras realizar una detallada caracterización fenotípica, concluimos que las células B de sangre son el modelo in vitro más adecuado y factible para alcanzar nuestro objetivo.

Irritable Bowel Syndrome (IBS) is a chronic and prevalent gastrointestinal disorder which curses with intestinal motility alterations and abdominal pain. IBS constitutes a relapsing and potentially disabling disorder and, currently, there is no specific diagnosis biomarker and only palliative treatments are available. The absence of a well-established pathophysiology highlights the need of identifying the underlying organic causes of motility alterations and the onset of symptoms. In the intestinal mucosa of these patients a certain degree of inflammation has been identified together with an increased intestinal permeability and a higher activity of the immune response. Previous studies from our group showed an increased humoral activity in the intestinal mucosa of diarrhea-predominant IBS (IBS-D) patients, associated with more severity of the symptoms. IBS patients often present anxiety and depression, and dysfunction of the gut-brain axis features IBS onset and outcome. Considering intestinal mucosa is highly innervated and the existence of a bidirectional modulation between nervous and immune systems, the main objective of this thesis was to characterize the activation humoral response by neuro-immune mechanisms in the intestinal mucosa of IBS-D patients.

To achieve our purpose, this project has been divided into three chapters. In chapter 1, we collected jejunal biopsies, blood and feces from IBS-D patients and healthy volunteers. We quantified immunoglobulins (Igs) in stool and observed higher levels of IgG in IBS-D group, more specifically IgG2 and IgG3, despite this last one did not reach statistical significance. The amount of total IgG positively correlated with the intensity of the abdominal pain reported by the patients. We conducted a phenotypical analysis in jejunal biopsies for the expression of CD38 and CD138 plasma cell marker, PGP9.5 neural marker and TACR1 (substance P receptor) expression, involved in nociceptive signaling. We observed that plasma cells and nerve endings are found in proximity and, when we performed a quantification of this distance by transmission electron microscopy (TEM), results showed plasma cells are significantly close to nerve endings in the IBS-D group. This distance inversely correlates with acute stress symptoms and depression score reported by patients, the later not reaching significance.

In Chapter 2, an RNA-seq analysis was conducted in RNA extracted from IBS-D patients and healthy volunteer jejunal biopsies. We performed a Gene Set Enrichment Analysis with all the genes in these samples; we observed the humoral response immunological phenotype is enriched and 60% of the genes with a highest enrichment score are involved in Ig structure. Pathways associated to intestinal barrier function are also overrepresented in IBS-D.

Finally, in Chapter 3, we evaluated several sources to obtain a B cell in vitro model to study the effect of neuropeptides on immune activity, more specifically substance P, in B cell activation/differentiation and Ig production. We confronted primary culture cells (B and plasma cells isolated from intestinal mucosa and blood) and an established B cell line (126BLCL). In vitro differentiated plasma cells obtained from blood were also analyzed. After conducting a deep phenotypic characterization, we concluded blood isolated B cells are the most suitable and feasible in vitro model for our purpose.

The results of this thesis reinforce the hypothesis of the neuro-immune crosstalk in the intestinal as playing a crucial role in IBS pathophysiology.