Immune and protective role of vaccines against Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium in laying hens

Abstract

La salmonel·losi és una zoonosi causada per soques no adaptades de bacteris del gènere Salmonella. La Salmonella es troba habitualment a l’intestí d’ocells i mamífers sans i pot entrar a la cadena alimentària mitjançant la contaminació de carn, ous i els seus productes derivats. El consum d’aliments o aigua infectada amb Salmonella causa gastroenteritis en humans. L’últim informe de l’European Food Safety Authority indica que aquest bacteri va ser la segona causa de zoonosi en humans a la Unió Europea el 2018. En particular, Salmonella va causar un terç de tots els brots alimentaris (30,7%). Gairebé la meitat d’aquests brots van ser causats per ous i productes derivats (45,6%), i la majoria (70%) van ser causats només per dues serovarietats: Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium. L’any 2003 la UE va començar a implementar els Programes Nacionals de Control de Salmonella a tots els estats membres per reduir la prevalença. Aquests plans van consistir en mesures de bioseguretat i eines addicionals com la vacunació, i van aconseguir una reducció important de la prevalença. Les serovarietats no adaptades de Salmonella no causen malaltia clínica en gallines majors de 3 dies. Per tant, l’objectiu principal de les vacunes contra aquestes serovarietats en aus és augmentar la resistència dels animals contra la infecció per tal de reduir la contaminació dels productes derivats. L’objectiu principal d’aquesta tesi va ser determinar la funció protectora d’una soca viva atenuada de Salmonella Typhimurium (sola o combinada amb una soca de Salmonella Enteritidis) contra les infeccions de soques de camp i avaluar la resposta immune associada. Es van realitzar tres estudis en tres èpoques de producció diferents en gallines. En el primer estudi, l’objectiu va ser determinar l’eficàcia d’una primera dosi de vacuna a dia de vida comparant l’administració oral i via aerosol, després d’una infecció als 14 dies de vida. Els animals vacunats via oral van estar parcialment protegits i es va reduir la colonització en òrgans interns, fet que indica la necessitat d’utilitzar dosis addicionals de vacuna per desenvolupar una immunitat més forta contra la Salmonella. La protecció no es va correlacionar amb la resposta humoral o cel·lular. L’administració de vacuna via aerosol va fallar, indicant la importància de la ruta d’administració. En el segon estudi, es va provar l’eficàcia de la vacuna després de 2 dosis (amb infecció experimental a les 16 setmanes de vida) o 3 dosis (infecció experimental a les 35 setmanes de vida). Els dos grups vacunals van reduir l’excreció de Salmonella i la colonització d’òrgans interns. Aquesta resposta immune adaptativa protectora no es va correlacionar amb els nivells d’anticossos (que van ser més alts a l’intestí d’animals no vacunats), però es correlacionà amb un augment general de la població de cèl·lules T CD3+ a l’intestí i amb l’expressió d’IFNγ, fet que indica una possible deriva cap a una resposta immune Th1. Al tercer estudi, es va determinar l’eficàcia de la vacunació durant la cria amb una vacuna combinada de Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium al final del període de posta. Els animals vacunats van reduir l’excreció de Salmonella Enteritidis i Salmonella Typhimurium en femtes i van estar protegits contra la colonització d’òrgans interns. La protecció no es va relacionar amb la resposta humoral, però si amb una resposta cel·lular a l’intestí. Els resultats extrets d’aquesta tesi indiquen que les vacunes estudiades podrien ser una eina útil per disminuir la transmissió vertical als ous (reduint la infecció d’òrgans interns) i la transmissió horitzontal a ous i productes avícoles (reduint l’excreció) per atenuar el risc de salmonel·losi en humans.

La salmonelosis es una zoonosis causada por cepas bacterianas no adaptadas del género Salmonella. La Salmonella se encuentra comúnmente en el intestino de aves y mamíferos sanos y puede entrar a la cadena alimentaria a través de la contaminación de carne, huevos y sus productos derivados. El consumo de alimentos o agua contaminada con Salmonella causa gastroenteritis en humanos. El último informe de la European Food Safety Authority indica que esta bacteria fue la segunda causa de zoonosis en humanos en la Unión Europea en 2018. En particular, Salmonella causó un tercio de todos los brotes transmitidos por alimentos (30.7%). De estos brotes, casi la mitad fueron causados por huevos y sus derivados (45,6%), y la mayoría (70%) fueron causados por solo dos serovariedades: Salmonella Enteritidis y Typhimurium. El año 2003, la Unión Europea comenzó a implementar los Programas Nacionales de Control de Salmonella en todos los estados miembros para reducir la prevalencia. Estos planes consistieron en medidas de bioseguridad y herramientas adicionales como la vacunación, y lograron una reducción importante en la prevalencia. Las serovariedades no adaptadas de Salmonella no causan enfermedad clínica en gallinas mayores de 3 días. Por lo tanto, el objetivo principal de las vacunas contra estos serotipos en aves es aumentar la resistencia de los animales contra la infección para reducir la contaminación de los productos derivados. El objetivo principal de esta tesis fue determinar la función protectora de una cepa viva atenuada de Salmonella Typhimurium (sola o combinada con una cepa de Salmonella Enteritidis) contra las infecciones por cepas de campo y evaluar la respuesta inmune asociada. Se realizaron tres estudios en tres tiempos de producción diferentes en gallinas. En el primer estudio, el objetivo era determinar la eficacia de una primera dosis de vacuna a día de vida comparando la administración oral y vía aerosol, tras una posterior infección a los 14 días de vida. Los animales vacunados estuvieron parcialmente protegidos y se redujo la colonización en órganos internos, lo que indica la necesidad de utilizar dosis adicionales de vacuna para desarrollar una inmunidad más fuerte contra la Salmonella. La protección no se correlacionó con la respuesta inmune humoral o celular. La administración de vacuna vía aerosol falló, indicando la importancia de la ruta de administración. En el segundo estudio, se probó la eficacia de la vacuna después de 2 dosis (con infección experimental a las 16 semanas de vida) o 3 dosis (infección experimental a las 35 semanas de vida). Ambos grupos vacunales redujeron la excreción de Salmonella y la colonización de órganos internos. Esta respuesta inmune adaptativa protectora no se correlacionó con los niveles de anticuerpos (que fueron más altos en el intestino de animales no vacunados), pero se correlacionó con un aumento general de la población de células T CD3+ en intestino y con la expresión de IFNγ, lo que indica una deriva hacia una respuesta inmune Th1. En el tercer estudio, se determinó la eficacia de la vacunación durante la cría con una vacuna combinada de Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium al final del periodo de puesta. Los animales vacunados redujeron la excreción de Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium en heces y estuvieron protegidos contra la colonización de órganos internos. La protección no se relacionó con la respuesta humoral, pero si con una respuesta celular en el intestino incluyendo la infiltración de macrófagos, células T CD4+ y CD8+. Los resultados extraídos de esta tesis indican que las vacunas estudiadas podrían ser una herramienta útil para disminuir la transmisión vertical a los huevos y la transmisión horizontal a huevos y productos avícolas para atenuar el riesgo de salmonelosis en humanos.

"Salmonellosis is a zoonosis caused by non-adapted bacterial strains of the genus Salmonella. Salmonella is commonly found in the intestines of healthy birds and mammals and can enter the food chain through contaminated meat, eggs and their products. Consumption of food or water contaminated with Salmonella causes gastroenteritis in humans. The last report from the European Food Safety Authority indicates that this bacterium was the second cause of human zoonosis in the European Union in 2018. Particularly, Salmonella caused one third of all foodborne outbreaks (30.7%). From these outbreaks almost half were caused by eggs and egg products (45.6%), and most (70%) were caused by only two serovars: Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium.

In 2003 the EU started to implement the Salmonella National Control Programmes in all member states to reduce Salmonella prevalence in the poultry and pig industry. These plans consisted in measures of biosafety and additional tools like vaccination against Salmonella, which achieved an important reduction in prevalence and the consequent reduction of reported cases of human salmonellosis.

Non-adapted serovars do not cause clinical disease in hens older than 3 days. Therefore, the main objective of vaccines against these Salmonella serovars in poultry is to increase resistance of animals against infection in order to reduce the contamination of poultry derived products.

The main objective of this thesis was to determine the protective function of a live attenuated Salmonella Typhimurium strain (alone or combined with a Salmonella Enteritidis strain) against field strains infections and to evaluate the associated immune response. Three studies were carried out at three different production times in hens.

In the first study the objective was to determine the efficacy of a first vaccine dose at day-old after challenge at 14 days comparing oral and spray administration. The oral vaccination partially protected and reduced colonisation in internal organ, indicating the need of additional vaccine boosters to develop a stronger immunity against Salmonella. The protection was not correlated with humoral or cellular immune response. The spray administration failed, and animals were not protected, indicating the importance of the administration route.

In the second study, the efficacy of the vaccine was tested after 2 vaccine doses (challenged at 16 weeks of life) or 3 vaccine doses (challenged at 35 weeks of life). Both vaccine groups had reduction of Salmonella excretion and colonisation of internal organs. This adaptive protective immune response was not correlated with levels of antibodies (which were especially higher in non-vaccinated animals in the intestine), but was correlated with a general increase in CD3+ T cell population in the intestine and a IFNγ; up-regulation, indicating a possible drift to a protective Th1 immune response.

In the third study, the efficacy of vaccination during rearing with a combined Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium vaccine was determined at the end of the laying period. Vaccinated animals had reduced rates of Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium excretion in cloacal swabs and were protected against internal organ colonisation. The protection was not related with humoral response but with a cellular response in the intestine including the infiltration of macrophages, CD4+ and CD8+ T cells.

The results extracted from this thesis indicate that the tested vaccines could be a useful tool to decrease vertical transmission to eggs (reducing infection of internal organs) and horizontal transmission to eggs and poultry products (reducing excretion of bacteria) to ultimately minimise the risk of salmonellosis in humans.