Combined therapy for type 1 diabetes: Immunotherapy and Regenerative Strategies

Abstract

La diabetis tipus 1 (DT1) és una malaltia metabòlica causada per la destrucció autoimmunitària de les cèl·lules β productores d’insulina. Actualment, l’únic tractament consisteix en l’administració exògena d’insulina. Desafortunadament aquest tractament no permet un manteniment continu de la normoglucèmia i pot ocasionar episodis de disglicemia. Aquests esdeveniments són els responsables de complicacions a curt i llarg termini.

Una alternativa per a superar la pèrdua de cèl·lules β en la DT1 és la regeneració de cèl·lula β. Pel fet que el disseny de molècules amb potencial terapèutic és un procés llarg, aquest estudi pretenia identificar compostos ja existents i aprovats que mostressin potencial de regeneració de cèl·lula β mitjançant Reposicionament de Fàrmacs. Aquesta és una tècnica in silico utilitzada per a buscar nous usos a fàrmacs ja aprovats per al seu ús en pacients.

El Reposicionament de Fàrmacs aplicats a vies de senyalització implicades en la regeneració de cèl·lula β va resultar en la identificació de liraglutide —un agonista de Glucagon-*like Peptide 1— com a fàrmac regenerador. Amb l’administració de liraglutide a ratolins NSG immunodeficients es va observar una millora transitòria de la hiperglucèmia durant el tractament. Aquesta millora va correlacionar amb l’aparició de cèl·lules bihormonals (glucagó+insulina+) i cèl·lules Citoqueratina19+insulina+ en les àrees ductals. A més, l’administració de liraglutide combinat amb una immunoteràpia prèviament desenvolupada i basada en liposomes amb fosfatidil-serina també va reduir la hiperglucèmia en ratolins no-obesos diabètics amb patologia autoimmunitària. Així mateix, l’addició de 12

liraglutide no va alterar el fenotip tolerogènic induït per PS-liposomes en cèl·lules dendrítiques obtingudes de pacients adults amb DT1.

Finalment, amb l’objectiu d’identificar etapes òptimes per a la immuno-intervenció, es van garbellar biomarcadors candidats en sang perifèrica de pacients pediàtrics amb DT1. La fase de remissió parcial, popularment coneguda com a lluna de mel, és una etapa interessant a causa de la millora parcial de la hiperglucèmia al costat d’una disminució dels requeriments d’insulina exògena. Això va portar a la identificació de molècules circulants, com ara TGF-*β i betatrofina, així com subpoblaciones leucocitàries reguladores que es proposen com biomarcadors candidats d’etapes inicials de la DT1 pediàtrica.

En conjunt, els resultats presentats en aquesta tesi doctoral descriuen la identificació de liraglutide com a fàrmac reposicionat amb efecte regeneratiu en cèl·lules β pancreàtiques i que mostra un potencial terapèutic en la diabetis autoimmunitària experimental quan es combina amb una immunoteràpia. En efecte, la identificació de biomarcadors candidats d’etapes primerenques de DT1 encamina la selecció de fases òptimes per a futurs assajos de immuno-intervenció.

La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad metabólica causada por la destrucción autoinmunitaria de las células β productoras de insulina. Actualmente, el único tratamiento consiste en la administración exógena de insulina. Desafortunadamente este tratamiento no permite un mantenimiento continuo de la normoglicemia y puede ocasionar episodios de disglicemia. Estos eventos son los responsables de complicaciones a corto y largo plazo.

Una alternativa para superar la pérdida de células β en la DT1 es la regeneración de célula β. Debido a que el diseño de moléculas con potencial terapéutico es un proceso largo, este estudio pretendía identificar compuestos ya existentes y aprobados que mostrasen potencial de regeneración de célula β mediante Reposicionamiento de Fármacos. Esta es una técnica in silico utilizada para buscar nuevos usos a fármacos ya aprobados para su uso en pacientes.

El Reposicionamiento de Fármacos aplicados a vías de señalización implicadas en la regeneración de célula β resultó en la identificación de liraglutide —un agonista de Glucagon-like Peptide 1— como fármaco regenerador. Con la administración de liraglutide a ratones NSG inmunodeficientes se observó una mejora transitoria de la hiperglicemia durante el tratamiento. Esta mejora correlacionó con la aparición de células bihormonales (glucagón+insulina+) y células Citoqueratina19+insulina+ en las áreas ductales. Además, la administración de liraglutide combinado con una inmunoterapia previamente desarrollada y basada en liposomas con fosfatidil-serina también redujo la hiperglicemia en ratones no-obesos diabéticos con patología autoinmunitaria. Asimismo, la adición de

12

liraglutide no alteró el fenotipo tolerogénico inducido por PS-liposomas en células dendríticas obtenidas de pacientes adultos con DT1.

Finalmente, con el objetivo de identificar etapas óptimas para la inmuno-intervención, se cribaron biomarcadores candidatos en sangre periférica de pacientes pediátricos con DT1. La fase de remisión parcial, popularmente conocida como luna de miel, es una etapa interesante debido a la mejora parcial de la hiperglicemia junto a una disminución de los requerimientos de insulina exógena. Esto llevó a la identificación de moléculas circulantes, tales como TGF-β y betatrofina, así como subpoblaciones leucocitarias reguladoras que se proponen como biomarcadores candidatos de etapas iniciales de la DT1 pediátrica.

En conjunto, los resultados presentados en esta tesis doctoral describen la identificación de liraglutide como fármaco reposicionado con efecto regenerativo en células β pancreáticas y que muestra un potencial terapéutico en la diabetes autoinmunitaria experimental cuando se combina con una inmunoterapia. En efecto, la identificación de biomarcadores candidatos de etapas tempranas de DT1 encamina la selección de fases óptimas para futuros ensayos de inmuno-intervención.

Type 1 diabetes (T1D) is a metabolic disease caused by the autoimmune destruction of the insulin-producing β-cells in the pancreas. Currently, the only treatment available is the administration of exogenous insulin. Unfortunately, this treatment does not allow the continuous maintenance of normoglycaemia and may lead to dysregulation episodes. Also, these events are responsible for short- and long-term complications.

One alternative approach to overcome the loss of insulin-producing cells in T1D is β-cell regeneration. Because the design of new molecules with a therapeutic potential is a long process, this study aimed to identify already-existing and approved compounds with β-cell regenerative properties by drug repurposing (or repositioning). This is an in silico technique intended to search for novel uses of drugs available to be used in patients.

Drug repurposing of pathways targeted in β-cell regeneration resulted in the identification of liraglutide —an agonist of Glucagon-like Peptide 1— as a regenerative drug. When liraglutide was administered to diabetic and immunodeficient NSG mice there was observed a transient amelioration of hyperglycaemia throughout the treatment. It correlated well with the induction of bihormonal (glucagon+insulin+) cells and Cytokeratin19+insulin+ cells in the ductal areas. Furthermore, the administration of liraglutide combined with previously developed immunotherapy based on phosphatidyl-serine liposomes also ameliorated hyperglycaemia in autoimmune non-obese diabetic mice. Moreover, the addition of liraglutide did not alter the induction of a tolerogenic phenotype by PS-liposomes in human dendritic cells from adult subjects with T1D.

10

Finally, with the aim to identify optimal stages for immune intervention, several candidate biomarkers were screened in peripheral blood from paediatric subjects with T1D. The PR phase, also known as honeymoon, is an interesting stage due to partial recovery of the hyperglycaemia along with lower insulin requirements. This resulted in the identification of circulating molecules, like TGF-β and betatrophin, and regulatory immune cell subsets that arise as candidate biomarkers of early stages of paediatric T1D.

Altogether, the results presented in this PhD thesis describe the identification of liraglutide as a repurposed drug for islet β-cell regeneration and its therapeutic potential in experimental autoimmune diabetes when combined with an immunotherapeutic strategy. Indeed, the identification of candidate biomarkers of early phases of T1D points toward the selection of optimal stages for future immune intervention trials.